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Jun 08, 2023

Rapid Prototyping für hohe

Wissenschaftliche Berichte Band 13,

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 1232 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Details zu den Metriken

Die Soft-Lithographie hat die schnelle Prototypenerstellung präziser mikrofluidischer Merkmale ermöglicht, indem ein verformbares Elastomer wie Polydimethylsiloxan (PDMS) mit einer fotolithografisch strukturierten Form strukturiert wurde. Für Mikrofluidikanwendungen, bei denen die Flexibilität von PDMS einen Nachteil darstellt, wurden verschiedene steifere Materialien vorgeschlagen. Im Vergleich zu Alternativen weisen aus Epoxidharz und Glas hergestellte Geräte eine überlegene mechanische Leistung, Merkmalsauflösung und Lösungsmittelkompatibilität auf. Hier stellen wir eine detaillierte Schritt-für-Schritt-Methode zur Herstellung starrer mikrofluidischer Geräte aus Epoxidharz und Glas mit weichem Lithographiemuster bereit. Das Klebeprotokoll wurde optimiert, um Geräte zu erhalten, die Drücken von mehr als 500 psi standhalten. Mit dieser Methode demonstrieren wir die Verwendung starrer spiralförmiger Mikrokanäle mit hohem Aspektverhältnis für die Zellfokussierung mit hohem Durchsatz.

Rapid-Prototyping-Techniken beschleunigen die Entwicklung mikrofluidischer Technologien im Frühstadium, indem sie die Iterationszeit und die Vorabkosten reduzieren. Die vielleicht am weitesten verbreitete Rapid-Prototyping-Technik für die Mikrofluidikforschung ist die Soft-Lithographie, bei der typischerweise ein Polydimethylsiloxan (PDMS)-Elastomerteil aus einer Form eines mikrostrukturierten Fotolackfilms auf einem Siliziumwafer strukturiert wird1. Das relativ weiche und zähe PDMS-Teil wird von der starren Silikonform abgehoben. Die Hauptvorteile der Soft-Lithographie im Vergleich zu alternativen Rapid-Prototyping-Methoden wie dem 3D-Druck liegen in der hervorragenden Strukturauflösung, die die Dünnschicht-Photolithographie auf Siliziumwafern bietet, sowie in der Möglichkeit, schnell mehrere Elastomerbauteile aus einer einzigen Waferform herzustellen .

Allerdings ist die Verformbarkeit von PDMS ungünstig für Mikrofluidikanwendungen, die moderate Drücke erfordern und bei denen die Kanalgeometrie wichtig ist. Dies ist beispielsweise bei praktisch allen Studien zu Trägheitsphänomenen der Mikrofluidik der Fall, bei denen es im Allgemeinen um Strömungen mit relativ hohem Druck (P > 30 psi) in relativ langen Mikrokanälen (> 1 cm) geht. PDMS-Geräte beginnen sich bereits bei 15 psi zu verformen und können bei Drücken von etwa 40–60 psi2 reißen. Daher kann die Verwendung von PDMS sowohl Forschungsergebnisse gefährden, bei denen die Verformbarkeit eine wesentliche Quelle experimenteller Variabilität sein kann, als auch die translatorische Entwicklung, da in größeren Herstellungsprozessen überwiegend Thermoplaste verwendet werden, die viel steifer als PDMS sind. In diesen Fällen wäre es ratsam, zunächst mikrofluidische Designs in einem starren Material zu validieren, bevor die erheblichen Werkzeugkosten für Spritzguss oder Prägung übernommen werden.

Diese Überlegungen motivierten mehrere Gruppen zur Entwicklung neuer Techniken für das Prototyping starrer Geräte, die 2011 systematisch überprüft wurden3. Diese Bemühungen demonstrierten die Herstellung starrer Geräte aus einem fotolithografisch definierten Muster durch Spritzpressen unter Verwendung einer PDMS-Zwischenreplik. Unter den bewerteten Materialien wies die 2007 erstmals beschriebene Duroplast-Rezeptur die höchste Steifigkeit und beste Klebeleistung (mindestens 150 psi)4 auf. Später wurde ein weiterer transparenter Duroplast, das Epoxidharz EpoxAcast 690, verwendet, um die Partikelfokussierung bei sehr hohen Durchflussraten und Betriebsdrücken von annähernd 10.000 psi5,6 zu messen. Es wurde auch gezeigt, dass dasselbe Material eine ausgezeichnete chemische Inertheit und Gasundurchlässigkeit aufweist7. Es wurde auch gezeigt, dass ein Epoxidchip zirkulierende Tumorzellen aus Vollblut basierend auf ihrer Größe mit einer Effizienz von etwa 80 % einfangen kann8. Basierend auf diesen Studien kann davon ausgegangen werden, dass Epoxidglas-Geräte im Hinblick auf Merkmalstreue, Steifigkeit und Bindungsstärke die gleichen oder sogar bessere Eigenschaften als alle anderen untersuchten Rapid-Prototyping-Materialien aufweisen. Insgesamt weisen fotolithografisch strukturierte Geräte im Vergleich zu alternativen Rapid-Prototyping-Methoden wie 3D-Druck oder gemusterten Laminatfolien die höchste Merkmalsauflösung und Wandglätte auf9. Ebenso sind kommerziell erhältliche Epoxidharze für Forscher leichter zugänglich als kundenspezifische Materialien10.

Trotz der vielen Vorteile starrer Geräte werden starre Materialien in der Literatur selten verwendet, selbst wenn dies gerechtfertigt ist. Ein detailliertes Schritt-für-Schritt-Protokoll kann die Zugänglichkeit des Prototypings starrer Geräte für Mikrofluidiklabore, die bereits Softlithographie und PDMS verwenden, erheblich verbessern. Um diesem Bedarf gerecht zu werden, beschreiben wir die häufigsten Fallstricke bei der Formvorbereitung und Geräteverklebung und wie sie behoben werden können. Darüber hinaus optimieren wir mehrere wichtige Prozessparameter, um die Bindungsstärke zu maximieren und gleichzeitig die Einfachheit und begrenzten Ressourcen des Protokolls beizubehalten.

Das Verfahren besteht aus drei Hauptschritten: (1) PDMS-Formvorbereitung, (2) Epoxidharzgießen und (3) Formtrennung, Nachbearbeitung und Verklebung (Schema, Abb. 1 und Beispielbilder, Abb. 2). Nach der Formvorbereitung (1) kann die Form sicher gelagert werden und der Rest der Fertigung kann jederzeit durchgeführt werden. Wenn das Epoxidharz gegossen wird (2), erfolgt die Entformung (3) am folgenden Tag, nach 20–24 Stunden, und die Verklebung erfolgt unmittelbar nach der Entformung (3). Bei diesem Verfahren wird davon ausgegangen, dass Sie mit der herkömmlichen weichen Lithographie von PDMS unter Verwendung einer starren Siliziumwaferform vertraut sind1. Bevor Sie beginnen, benötigen Sie eine Masterform mit den gewünschten Strukturmerkmalen, beispielsweise eine strukturierte SU-8-Dünnschicht auf einem Siliziumwafer. Wie unten beschrieben, sollten die Kanäle im endgültigen Gerät wie bei herkömmlichen PDMS-Geräten erhabene Merkmale auf der Masterform aufweisen.

Gesamtverfahren zur Herstellung eines mikrofluidischen Geräts auf Epoxidbasis.

Beispielbilder von Protokollphasen. Von links nach rechts und von oben nach unten: (a) Schneiden von PDMS vom SU-8-Wafer, (b) PDMS-Replik in der Petrischale nach oben, (c) PDMS über das Replikat gießen, (d) Lösen der PDMS-Form vom Replikat , (e) die endgültige PDMS-Form ohne das Replikatgerät, (f) PDMS-Form mit Schläuchen ohne Epoxidharz, (g) nach 24 Stunden aus der Form genommenes Epoxidgerät mit noch befestigten PFTE-Stäben auf der Seite und (h) Das endgültige Epoxidgerät ist mit einem Objektträger aus Glas verbunden.

In Bezug auf das Protokoll als Ganzes hatten wir mehrere wichtige Beobachtungen. Erstens können die mit TCPFOS behandelten Replikate, die zur Herstellung der PDMS-Form verwendet werden, wiederverwendet werden, jedoch nur zwei bis drei Mal. Darüber hinaus kann es zu Verformungen der Oberfläche der Nachbildung kommen. Andererseits können die PDMS-Geräteformen viele (mehr als 10) Mal wiederverwendet werden. Mit der Zeit kann der Schimmel eine undurchsichtige weiße Farbe annehmen. Es hat keine Auswirkungen auf das Gerät oder die PDMS-Form. Darüber hinaus kann das Schneiden der Polytetrafluorethylen (PFTE)-Stäbe in einem leichten Winkel das Einsetzen in die Formen erleichtern. Schließlich sollte das Rohrmaterial so ausgewählt werden, dass es mit der Epoxidklebung kompatibel ist. Wir verwenden Polyethylenschläuche, die eine starke Verbindung mit dem Epoxidharz eingehen. Gängige Schlauchmaterialien wie Tygon® oder fluoriertes Ethylenpropylen (FEP) reagieren nicht mit dem Epoxidharz.

Wir haben mehrere Prozessvariablen optimiert mit dem Ziel, Geräte zuverlässig herstellen zu können, die hohen Drücken standhalten. Die Aushärtezeit vor dem Entfernen der Form, die Plasmabehandlungszeit und die Ruhezeit auf der Heizplatte nach dem Verkleben wurden optimiert. Um die Haftfestigkeit eines Geräts zu testen, haben wir das Gerät mit nur einem einzigen Anschluss (dh ohne Auslässe) hergestellt und es mit einem integrierten Druckwandler an die Hochdruckspritzenpumpe Modell 100Dx angeschlossen. Das Gerät wurde im Laufe mehrerer Minuten schrittweise mit entionisiertem Wasser unter Druck gesetzt, bis es zu einem Ausfall kam, und der Spitzendruck vor dem Ausfall wurde aufgezeichnet.

Zunächst stellten wir die Hypothese auf, dass die Verwendung einer kürzeren Aushärtezeit als 24 Stunden die Haftfestigkeit erhöhen könnte, wenn das Epoxidharz über mehr verfügbare reaktive Gruppen verfügt. Bei Aushärtezeiten von weniger als 20 Stunden war das Epoxidharz zu weich und klebrig, um es aus der Form zu entfernen. Andererseits stellten wir bei Aushärtezeiten über 30 Stunden fest, dass das Epoxidharz fast vollständig ausgehärtet war und sich nicht mit dem Glasobjektträger verbinden ließ. Innerhalb dieses Fensters beobachteten wir einen Trend zu höheren Bindungsdrücken bei kürzeren Aushärtezeiten, mit einem Maximum von 670 psi bei der niedrigsten getesteten Aushärtezeit von 20 Stunden (Abb. 3a).

Optimierung der Haftfestigkeit. Bindungsstärke im Vergleich zu (a) Aushärtungszeit, (b) Dauer der Plasmabehandlung und (c) Zeit, die das Gerät nach der Plasmabehandlung auf einer heißen Platte ruht. Die Drücke reichen von 650 bis 240 psi. Die Festigkeit wurde getestet, indem eine Hochdruckpumpe unter Verwendung eines Swagelok mit einer anfänglichen Durchflussrate von 1 ml/min und einer endgültigen Durchflussrate von 0,1 ml/min an die Geräte angeschlossen wurde. Das endgültige Durchschnittsgewicht aller getesteten Geräte beträgt 6,57 g.

Als nächstes untersuchten wir die Auswirkungen von Plasma und Heizplattenzeit auf die Bindungsfestigkeit. Die Plasmabehandlung des Glasobjektträgers reinigt die Oberfläche und macht sie hydrophiler. Nach Angaben des Herstellers des Plasmagenerators mit einem empfohlenen Startpunkt von 20 s reichte der getestete Bereich der Plasmabehandlungszeiten von null bis 60 s. Alle Geräte, die mindestens 5 s lang einer Plasmabehandlung unterzogen wurden, zeigten eine ähnliche Leistung (Abb. 3b), wobei der höchste Druck nach 30 s durchschnittlich 510 psi erreichte. Die Geräte, die keine Plasmabehandlung erhielten, hatten die niedrigste Haftfestigkeit und versagten bei etwa der Hälfte des Drucks, den plasmabehandelte Geräte erreichen konnten. Der Bereich der getesteten Heizplattenzeiten reichte von 0 bis 3 Minuten. Nach 3 Minuten auf der Heizplatte erreichten die Geräte ihren durchschnittlichen Höchstwert von 530 psi, bevor sie ausfielen. Nach 3 Minuten wurde jedoch beobachtet, dass sich die Geräte manchmal verzogen und von der Glasoberfläche abhoben. Dennoch schienen Geräte, die mehr Hitze abbekamen, auch stärker zu sein (Abb. 3c). Ruhezeiten auf der Heizplatte unter 1 Minute zeigten keine Unterschiede.

Da die Druckdurchlaufexperimente relativ schnell verliefen (~ 2 Minuten), haben wir auch getestet, ob die Geräte über einen längeren Zeitraum ähnlich hohen Drücken standhalten würden. Wir haben ein Gerät unter Verwendung des oben beschriebenen Protokolls bei einer 24-Stunden-Aushärtung hergestellt und es in Schritten von 100 psi unter Druck gesetzt, wobei alle 10 Minuten ein Anstieg um 100 psi zu verzeichnen war. Wir haben beobachtet, dass das Gerät einem Druck von 100 psi eine Stunde lang standhalten konnte. Es konnte auch mindestens 10 Minuten bei 200 und 300 psi durchhalten. Das Gerät versagte bei 400 psi nach 6 Minuten, was der auf der Grundlage der Druckdurchlaufexperimente erwarteten Gerätefestigkeit entsprach (Abb. 3b).

Schließlich stellten wir zwei endgültige Chips unter Verwendung eines Protokolls her, von dem wir aufgrund der Optimierungsergebnisse erwarteten, dass es optimal für die Maximierung der Bindungsfestigkeit ist (20 Stunden Aushärtungszeit, 30 Sekunden für die Plasmabehandlung und 3 Minuten auf der Heizplatte). Dies führte zu einem Gerät, das basierend auf zwei Chips einem durchschnittlichen Druck von 714,5 psi standhalten konnte, etwa 12 % mehr als der vorherige höchste Zustand während der Optimierung.

Wir haben das optimierte Herstellungsprotokoll verwendet, um spiralförmige Mikrokanäle mit einem sehr hohen Seitenverhältnis herzustellen und ihre Leistung für die inertioelastische Zellfokussierung mit hohem Durchsatz zu testen. Bei biomedizinischen Anwendungen der Trägheitsfokussierung mit großen Probenvolumina muss die maximale Scherbeanspruchung der Zellen in Grenzen bleiben, um Schäden zu vermeiden. Aus später erläuterten Gründen stellten wir die Hypothese auf, dass ein Mikrokanal mit sehr hohem Seitenverhältnis (dh 10:1 oder mehr) mehrere Vorteile hätte. Allerdings neigen Kanäle mit hohem Seitenverhältnis auch eher dazu, sich unter Druck aufzublähen, wenn sie aus verformbaren Materialien hergestellt sind.

Wir stellten einen einzelnen Mikrokanal mit einer Höhe von 100 µm, einer Breite von 1 mm und einer Länge von etwa 140 mm her, der zu einer Spirale mit einer Gesamtbreite von etwa 17 mm aufgewickelt war (Abb. 4a). Eine viskoelastische Lösung von Hyaluronsäure wurde durch Auflösen von 1,5 MDa lyophilisierter HA in phosphatgepufferter Kochsalzlösung auf eine Konzentration von 0,5 mg/ml durch sanftes Mischen über Nacht hergestellt. Jurkat-Zellen mit einer Größe von etwa 12 µm wurden in der viskoelastischen Lösung resuspendiert und mit Flussraten von bis zu 2,4 ml/min in die Mitte der Spirale gepumpt. Zellen innerhalb des Kanals wurden mit einem 10-fachen Hellfeldmikroskop abgebildet (Abb. 4b). Die seitliche Verteilung der Zellen in der Nähe des Auslasses wurde durch die Aufnahme von > 100 Zeitrafferbildern bei jeder Durchflussrate quantifiziert, gefolgt von einer Bildverarbeitung, um die Zellen zu segmentieren und ihre seitlichen Positionen zu akkumulieren (Abb. 4c). Wie erwartet wurde oberhalb einer kritischen Flussrate von etwa 0,8 ml/min eine Vielzahl von Zellen auf einen einzigen stabilen Punkt nahe der äußeren (dh konkaven) Wand des Mikrokanals konzentriert. Darüber hinaus rückte der scheinbar stabile Punkt mit zunehmender Strömungsgeschwindigkeit näher an die Außenwand heran, was den Erwartungen entsprach. Oberhalb von 1 ml/min verbesserten sich die Fokussierungseigenschaften mit steigender Flussrate weiter leicht, bis hin zur höchsten getesteten Flussrate.

Trägheitselastische Zellfokussierung in einem starren spiralförmigen Mikrokanal mit hohem Seitenverhältnis. (a) Schematische Darstellung der Mikrokanalgeometrie. Der Einlass befindet sich in der Mitte der Spirale. (b) Repräsentative rohe und verarbeitete Bilder von Jurkat-Zellen unter Strömung in einer viskoelastischen Suspension von Hyaluronsäure. (c) Fokussierungsleistung, quantifiziert durch seitliche Verteilungen der Zellen von der inneren (konvexen) zur äußeren (konkaven) Wand bei steigenden Flussraten.

Mikrofluidische Geräte auf Epoxidbasis widerstehen Verformungen und halten höheren Drücken stand als PDMS-Geräte. Bei der Entwicklung dieses Protokolls bauen wir auf früheren Arbeiten zur Identifizierung von Epoxidharz als Hochleistungsmaterial auf, mit dem Ziel, dieses Protokoll für Mikrofluidiklabore auf der ganzen Welt zugänglicher zu machen, die bereits PDMS und Soft-Lithographie verwenden5,6,7.

Mit einem Gerät aus starrem Epoxidharz untersuchten wir die Fokussierungsleistung in Mikrokanälen mit hohem Aspektverhältnis. Verglichen mit Mikrokanälen mit mittlerem Seitenverhältnis (d. h. 4:1 oder weniger) haben gekrümmte Mikrokanäle mit hohem Seitenverhältnis den Vorteil, dass sie das Einsetzen von Dean-Fluss-Sekundärwirbeln bei höheren Reynolds-Zahlen unterdrücken, was eine effiziente Zellfokussierung bei höheren Flussraten ermöglicht11. Basierend auf den Messungen ähnlicher Verbindungen durch andere können die strömungsmechanischen Eigenschaften der Lösung (1,5 MDa, 0,5 mg/ml Hyaluronsäure in PBS) grob geschätzt werden als eine Null-Scherviskosität von etwa 5 mPa·s und eine Relaxationszeit von etwa 10 ms. Bei einer charakteristischen Kanalbreite von 100 µm würde die höchste getestete Flussrate von 2,4 ml/min einer Reynolds-Zahl von etwa 8 und einer Weissenberg-Zahl von etwa 40 entsprechen. Die beobachteten Fokussierungseigenschaften stimmen mit den Ergebnissen anderer Forscher überein, die Strömungen mit untersuchten eine ähnliche Elastizitätszahl, hier El = Wi/Re = 4,812,13.

Dieses Protokoll weist mehrere potenzielle Einschränkungen auf. Eine mögliche Einschränkung dieses Verfahrens besteht darin, dass es für Merkmale mit hohem Seitenverhältnis wie Säulen oder dünnen Wänden nicht ideal ist, da die Form freigegeben wird, wenn das Epoxidharzteil noch biegsam ist. Das Lösen und Verbinden von Geräten mit Funktionen mit sehr hohem Seitenverhältnis erfordert möglicherweise zusätzliche Optimierung und Übung. Dennoch bietet Epoxidharz hervorragende mechanische Eigenschaften und Oberflächenbeschaffenheit für Anwendungen mit hohem Durchsatz. Dieses detaillierte Protokoll wird es mehr Laboren ermöglichen, starre Geräte problemlos in ihre bestehenden PDMS-basierten Prototyping-Workflows zu integrieren.

Die Muster-Masterform, z. B. ein mikrostrukturierter SU-8-Dünnschicht-Siliziumwafer. Kanäle im endgültigen Gerät sollten erhabene Merkmale auf der Masterform sein, genau wie beim Formen eines herkömmlichen PDMS-Geräts.

*EpoxAcastTM 690 transparentes Epoxidharz-Kit (https://shop.smooth-on.com/epoxacast-690).

*Trichlor(1H,1H,2H,2H-perfluoroctyl)silan (TCPFOS) (Millipore Sigma, Artikel-Nr. 448931, https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/448931).

*Sylgard 184 Silikonelastomer-Kit (Ellsworth Adhesives, Artikel-Nr. 4019862, https://www.ellsworth.com/products/by-market/consumer-products/encapsulants/silicone/dow-sylgard-184-silicone-encapsulant-clear -0,5-kg-Kit/).

Polytetrafluoroethylene (PFTE) Rod 0.07″ (https://www.mcmaster.com/84935K82/).

Polyethylen (PE)-Schlauch 1/16″ ID (https://www.mcmaster.com/5648K67-5648K226/).

Kunststoff-Petrischalen 100 mm.

Petrischalen 175 mm mit Deckel.

Boot wiegen.

Heiße Platte.

Ultrareine Glasobjektträger (Fisher Scientific, Artikel-Nr. 22-037-213, https://www.fishersci.com/shop/products/ultraclean-microarray-slides-enhanced-surface/22037213?searchHijack=true&searchTerm=+C22-5128 -M20&searchType=RAPID&matchedCatNo=+C22-5128-M20).

Reinigen Sie einen Metallspatel mit abgerundetem Ende, z. B. (https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?product_id=4531745).

Pipetten.

Separate Vakuumkammer für TCPFOS-Aufdampfung (https://www.fishersci.com/shop/products/bel-art-scienceware-space-saver-vacuum-desiccators-3/0859416A?gclid=CjwKCAiAvK2bBhB8EiwAZUbP1OvPjQ-ZJAhbEmrVHglNDxRCoS1kEZrG47Yro7f3h4s NqjjlgiL0dRoCh7YQAvD_BwE&ef_id=CjwKCAiAvK2bBhB8EiwAZUbP1OvPjQ-ZJAhbEmrVHglNDxRCoS1kEZrG47Yro7f3h4sNqjjlgiL0dRoCh7YQAvD_BwE: G:s&ppc_id=PLA_goog_2086145680_81843405274_0859416A__386247001354_9967139677844655410&ev_chn=shop&s_kwcid=AL!4428!3!386247001354!!!g!827721 591040!0859416A).

Zahnpinzette, auch „Gewebe-“ oder „Rattenzahn“-Pinzette genannt, z. B. (https://www.wpiinc.com/14140-g-graefe-forceps-7cm-straight-07mm-1x2-teeth-german).

*Plasmagenerator (https://www.enerconind.com/plasma-treating/products/vintage-treaters/dyne-a-mite-hp.aspx).

Elektrische Ultrahochvakuumpumpe (Artikel-Nr. 4396K21, https://www.mcmaster.com/catalog/128/421).

*Lesen Sie sich unbedingt die Sicherheitsdatenblätter dieser Produkte durch und tragen Sie bei der Verwendung geeignete PSA.

Das Protokoll wird idealerweise in einer Reinraumumgebung durchgeführt, um eine Partikelkontamination zu vermeiden.

In diesem Schritt bereiten wir zunächst eine PDMS-Replik aus der Siliziumwafer-Masterform vor und verwenden diese dann zum Gießen einer PDMS-Form. Die PDMS-Form muss gestanzt werden, damit die Einlass- und Auslassschläuche während des folgenden Epoxidgussschritts an Ort und Stelle gehalten werden können. Ebenso können die PDMS-Masterformen viele (mehr als 10) Mal zum Gießen von Epoxidgeräten wiederverwendet werden.

Dieses Protokoll dient zur Herstellung von Geräten, die ähnlich groß oder kleiner als ein Standard-Glasobjektträger sind. Bei kleinen Geräten (z. B. 1–3 cm2) ist es möglich, eine einzelne PDMS-Form aus mehreren PDMS-Nachbildungen zu gießen.

Eine mögliche Gefahr bei der Formvorbereitung besteht darin, die gestanzten Löcher entweder etwas zu groß oder zu klein zu machen. In einem späteren Schritt werden PTFE-Stäbe in die Löcher eingeführt. Die Löcher sollten nur geringfügig kleiner sein (ca. 5 %) als der Durchmesser des PTFE-Stabs, um einen festen Sitz zu ermöglichen und ein Durchsickern von Epoxidharz zu verhindern. Wenn andererseits die gestanzten Löcher zu klein sind, ist es möglicherweise immer noch möglich, den Stab hineinzupassen, allerdings wird dadurch die PDMS-Oberfläche gedehnt und aufgrund des Poisson-Effekts nach unten gezogen. Dieser Pulldown wird dann auf das Epoxidharzteil übertragen und kann zu Problemen bei der Verklebung führen.

Eine zweite potenzielle Gefahr bei der Formvorbereitung, die auch mit dem Lochen verbunden ist, ist die Lochform. Eine herkömmliche runde Biopsie-Stanze kann einen PDMS-Teil erheblich komprimieren, bevor er durchbeißt, was zu einer Verengung des Lochs mit zunehmender Tiefe im entspannten PDMS-Teil führt. Diese Lochform kann einen kleinen „versenkten“ Umfang um einen eingepressten PTFE-Stab hinterlassen, und diese Eigenschaft kann auf das Epoxidharzteil übertragen werden und Probleme bei der Bindung verursachen.

Um diese beiden Probleme zu vermeiden, verwenden wir beim Stanzen einen 2 mm dicken PDMS-Opferabstandshalter oben auf der PDMS-Form. Nach unserer Erfahrung können mit einer 2,0-mm-Biopsiestanze geradewandige Löcher mit einem Durchmesser von 1,8 mm gebohrt werden, die für 0,07-Zoll-PFTE-Stäbe und Schläuche mit einem Innendurchmesser von 1/16 Zoll geeignet sind.

Zeit: 15 Min

Stellen Sie eine PDMS-Mischung von insgesamt 50 g her (45 g PDMS-Basis; 5 g Härter). Gut mischen.

Gießen Sie das PDMS über den SU-8-Wafer.

Legen Sie die Schale mit dem SU-8-Wafer und PDMS in die Vakuumkammer. Lassen Sie die Schale 1–3 Stunden lang stehen und übertragen Sie sie dann in einen 60 °C-Ofen, um das PDMS über Nacht auszuhärten.

Zeit: 15 Min

Entfernen Sie den PDMS-Guss vorsichtig aus der Silikonform.

Schneiden Sie das Replikat aus dem PDMS auf die gewünschte Größe aus.

Zeit: 35 Min

Führen Sie eine Sauerstoffplasmabehandlung des PDMS-Replikats durch.

Legen Sie die Replik in eine saubere 100-mm-Petrischale.

HINWEIS: Wenn die Geräte klein sind, ist möglicherweise Platz für mehrere Replikate in einer einzigen 100-mm-Petrischalenform. Stellen Sie sicher, dass sich die Replikate in der Schale nicht berühren, idealerweise mindestens 5 mm Abstand zwischen den Replikaten sowie zwischen allen Replikaten und der Petrischalenwand.

Pipettieren Sie 2 μl Tricholorperfluoroctylsilan (TCPFOS) und verteilen Sie es leicht auf der Petrischale, um einen Rand um die Repliken herum zu bilden.

HINWEIS: TCPFOS ist giftig. Verwenden Sie geeignete PSA.

Legen Sie die Petrischale für 30 Minuten in eine spezielle Vakuumkammer.

HINWEIS: Kleine Mengen TCPFOS können sich sowohl auf der Innen- als auch auf der Außenfläche der Petrischale ablagern und sollten entsprechend und unter Beachtung der entsprechenden Sicherheitsvorkehrungen gehandhabt werden. Fassen Sie das Gericht nicht ohne Handschuhe an.

Zeit: 15 Min

Stellen Sie eine PDMS-Mischung von insgesamt 50 g her (dies ergibt ~ 10 mm dickes PDMS in einer 100 mm Petrischale, z. B. zum Gießen auf Replikate mit einer Dicke von ~ 5 mm; 45 g PDMS-Basis; 5 g Härter). Gut mischen.

Gießen Sie die Mischung mit den Geräten in die 100-mm-Form. Stellen Sie sicher, dass sie vollständig abgedeckt sind.

HINWEIS: Notieren Sie sich, wie oft dieses Replikat verwendet wurde. Komme nicht über 2 Anwendungen hinaus. Zukünftige Geräte werden sich verziehen.

Stellen Sie die Schale in die Vakuumkammer. Lassen Sie die Schale 1–3 Stunden ruhen und geben Sie sie dann in einen 60 °C heißen Ofen, um PDMS über Nacht auszuhärten.

ÜBER NACHT.

Zeit: 15 Min

Entfernen Sie die PDMS-Form vorsichtig mit einem Metallspatel vollständig aus der Petrischale.

HINWEIS: Es kann hilfreich sein, die gegenüberliegenden Seitenwände der Kunststoff-Petrischale sehr sanft aufeinander zu drücken, um die gesamte Schale leicht zu biegen und das PDMS von der Schale zu trennen. Bei diesem Schritt kann es passieren, dass die Replik aus der Form fällt. Achten Sie bei diesem Schritt darauf, die Form oder das Replikat nicht zu beschädigen oder zu zerreißen.

Entfernen Sie das PDMS-Replikat vorsichtig mit einem sauberen Metallspatel oder einer Pinzette aus der Form.

HINWEIS: Es kann hilfreich sein, die gesamte PDMS-Form vorsichtig zu biegen, bis sich das Replikat von der Form zu lösen beginnt. Achten Sie bei diesem Schritt darauf, die Form oder das Replikat nicht zu beschädigen oder zu zerreißen.

Schneiden Sie die zusätzliche Lippe vom Rand der PDMS-Form ab. Testen Sie den Füllstand auf dem Tisch und klopfen Sie leicht darauf. es sollte bündig mit dem Tisch abschließen.

Stanzen Sie mit einem 2,0-mm-Lochstanzer die erforderlichen Löcher aus. Heben Sie das PDMS an und stanzen Sie den PDMS-Stecker von der anderen Seite heraus.

HINWEIS: Wir empfehlen, ein Ersatzstück PDMS über dem zu stanzenden Loch zu verwenden. Dies verhindert die Einschnürung des Lochs, das im Abschnitt „PDMS-Formvorbereitung“ des Protokolls beschrieben wird.

Wie in den wichtigsten Punkten erwähnt, reagieren bestimmte Materialien wie Tygon® und FEP nicht mit Epoxidharz. Wenn andere Materialien außerhalb dieses Protokolls verwendet werden, stellen Sie sicher, dass diese mit Epoxidharz reagieren.

Der Zweck des Einführens des PTFE-Stabs in den PE-Schlauch besteht darin, den PE-Schlauch während des Epoxidharzgießens und -härtens an Ort und Stelle zu halten. Es gewährleistet außerdem eine offene Verbindung zwischen dem Schlauch und den Mikroelementen für den Fall, dass Epoxidharz in das Loch eindringt. Im Abschnitt „Release and Bond“ des Protokolls werden die Stäbe später unter dem Gerät herausgenommen.

Reinigen Sie vor Beginn unbedingt die verwendete Oberfläche und den Schlauch mit 70 %igem Ethanol.

Zeit: 5 Min

Schneiden Sie den PTFE-Stab auf 6 mm und den PE-Schlauch auf 2 cm ab.

HINWEIS: Das schräge Abschneiden des PTFE-Schlauchs kann die Führung des Schlauchs beim Einführen erleichtern.

Stecken Sie den PTFE-Stab in den PE-Schlauch. Die Stange muss nicht vollständig in das größere Rohr hineinragen; Eine Tiefe von 1 mm ist ausreichend.

Platzieren Sie den Schlauch mit der Stange voran in einer gleichmäßigen Bewegung in den Löchern der Form. Der Schlauch sollte mindestens 1–2 mm unter der Oberseite der PDMS-Form liegen. Schieben Sie den Schlauch nicht ganz nach unten durch die Form. Bis zur Hälfte oder weniger in der Form reicht es aus; Der Schlauch sollte über der Form etwa 1–2 mm Platz haben. Siehe Abb. 1 als Referenz. Achten Sie bei diesem Schritt darauf, die Formoberfläche nicht zu beschädigen oder zu zerreißen.

HINWEIS: Sie können die Petrischale mit Form und Schlauch etwa 15 Minuten lang in einer Vakuumkammer belassen, während Sie unten die Epoxidmischung vorbereiten. Unserer Erfahrung nach kann das Entgasen der PDMS-Form vor dem Eingießen des Epoxidharzes dazu beitragen, kleine Blasen im fertigen Epoxidharzteil zu vermeiden.

Alle Epoxidharzarbeiten sollten in einem gut belüfteten Bereich durchgeführt werden. Lesen Sie alle Sicherheitsdatenblätter durch, bevor Sie Epoxidharz verwenden. Das in diesem Protokoll verwendete Epoxidharz hat eine Vergusszeit von 5 Stunden. Verschüttetes Epoxidharz kann mit 70 %igem Ethanol gereinigt werden. Wenn für kleinere Formen eine Mikropipette zum Eingießen des Epoxidharzes verwendet wird, achten Sie darauf, Spitzen mit Filtern zu verwenden, um zu verhindern, dass Epoxidharz in die Mikropipette gelangt.

Zeit: 10 Min

Messen Sie die erforderliche Menge der Mischung in ein Wiegeschiff ab. Flaschen mit Epoxidmischung vor Gebrauch gut schütteln. Das Verhältnis von Teil A zu Teil B beträgt 10 g:3 g.

HINWEIS: Die Dichten beider Teile unterscheiden sich von denen von Wasser. Die Masse der hinzugefügten Teile muss direkt gemessen werden. Teil A ist viel viskoser als Teil B. Eine Strategie für eine genaue Zubereitung besteht darin, eine ungefähre Menge Teil A direkt aus der Flasche zu gießen, dann die genaue Menge Teil B zu berechnen, um das Verhältnis 10:3 zu erreichen, und Teil B nach und nach hinzuzufügen.

Bringen Sie die Mischung in einen Abzug. 3 Min. sehr gut vermischen.

Geben Sie die Epoxidharzmischung in die elektrische Ultrahochvakuumpumpe, um das Epoxidharz zu entgasen.

Achten Sie auf die Bildung von Luftblasen. Blasen steigen an die Oberfläche, verbinden sich und platzen dann. Schalten Sie die Maschine aus, wenn die erste Blase zu kochen beginnt.

FEHLERBEHEBUNG: Wenn nach dem Ausschalten der Pumpe immer noch viele Blasen übrig sind, lassen Sie die Blasen einige Minuten lang ruhen und platzen, bevor Sie die Luft ablassen. Wenn nach dem Entgasen immer noch Blasen im Epoxidharz vorhanden sind, lassen Sie das Vakuum erneut laufen.

Verteilen Sie die Epoxidmischung sehr langsam bis zum tiefsten Punkt der Form. Lassen Sie das Epoxidharz von selbst in der Form verteilen. Lassen Sie das Epoxidharz nicht überlaufen oder Blasen bilden. Es sollte auf gleicher Höhe mit der Oberseite der PDMS-Form sein.

HINWEIS: Wenn die Form Blasen bildet, können Sie überschüssiges Epoxidharz mit einer Pipette entfernen. Ein Kimwipe® kann auch verwendet werden, um überschüssiges Epoxidharz aufzusaugen, indem man die Oberseite der Epoxidharzform berührt, bis sie eben ist.

FEHLERBEHEBUNG: Möglicherweise sind kleine Luftblasen auf den PDMS-Funktionen sichtbar. Es kann hilfreich sein, eine 10-μl-Pipettenspitze aus Kunststoff zu verwenden und die Form vorsichtig abzubürsten, um Blasen von der Formoberfläche zu lösen und sie an die Oberfläche des Epoxidharzes aufsteigen zu lassen. Auf dem Epoxidharz schwebende Blasen sind akzeptabel und platzen normalerweise während der Aushärtung.

Stellen Sie die Petrischale in den Abzug. Lassen Sie überschüssiges Epoxidharz 24 Stunden lang im Abzug, bevor Sie es entsorgen.

Lassen Sie das Epoxidharz über Nacht aushärten, normalerweise etwa 22–24 Stunden, je nach Umgebungstemperatur und Epoxiddicke. Wie oben beschrieben, lassen sich Geräte, die über einen längeren Zeitraum ausgehärtet wurden, im Allgemeinen leichter aus der Form lösen, weisen jedoch eine geringere Haftfestigkeit auf.

ÜBER NACHT

Die Variabilität der Bindungsfähigkeit hängt von diesem Abschnitt des Verfahrens ab. Diese Auswirkungen der Aushärtezeiten, der Plasmabehandlungszeit und der Ruhezeit auf der Heizplatte werden alle beobachtet und in den Ergebnissen beschrieben. Achten Sie auf kleine Details wie „Feathering“, überschüssiges Epoxidharz, das noch am Gerät haftet und möglicherweise beim Herausziehen des Stabs entstanden ist und nach dem Entfernen des PFTE-Stabs auftritt. Die vollständige Verbindung könnte durch Manipulationen an der Unterseite des Geräts nach dem Entfernen aus der PDMS-Form beeinträchtigt werden. Das Kleben von Geräten mit dünnen Wänden und anderen empfindlichen Elementen erfordert Übung.

Treffen Sie bei der Verwendung des Plasmagenerators entsprechende Sicherheitsvorkehrungen.

Zeit: 10 Min

Führen Sie schnelle kleine Biegungen an den Kanten der Geräte durch. Teilweise ausgehärtetes Epoxidharz sollte sich fest, gummiartig und klebrig anfühlen. Es ist unter dem Gerät sichtbar, wenn sich die Kanten vom PDMS lösen.

FEHLERBEHEBUNG: Wenn sich die Geräte zu diesem Zeitpunkt nicht deutlich aus der Form lösen, sind sie zu weich und benötigen mehr Zeit zum Aushärten. Schauen Sie in 1 bis 2 Stunden noch einmal vorbei und versuchen Sie es erneut.

Halten Sie die Röhren fest und ziehen Sie die Geräte schnell gerade aus dem PDMS. Das Epoxidharzteil kann sich beim Entfernen der Form verformen, entspannt sich jedoch innerhalb weniger Sekunden nach der Entformung wieder in seine geformte Form.

HINWEIS: Drehen Sie die Stange nicht. Mit der anderen Hand können Sie auch versuchen, die Form vom Epoxidharzgerät wegzubiegen. Dies hilft, das Gerät teilweise freizugeben und die PDMS-Wände wegzuziehen, während Sie das Gerät herausziehen.

Halten Sie das entsprechende Röhrchen fest und ziehen Sie die PTFE-Stäbe mit einer Pinzette sehr schnell von unten heraus. Berühren Sie nicht die Unterseite des Chips. Eine kleine Biegung des Rohrs hilft, das Rohr jedoch nicht verdrehen. Lassen Sie das Gerät in der Schüssel auf der Seite liegen, sobald die Stücke herausgenommen sind.

HINWEIS: Wenn Sie langsam vorgehen, kann es zu einer Biegung des Chips kommen. Es wird empfohlen, die im Abschnitt „Ausrüstung“ gezeigte Pinzette zu verwenden, da diese die Rute leicht greift.

FEHLERBEHEBUNG: Bei verbleibenden „Federn“ können Sie die Federn vorsichtig mit dem kürzlich entfernten Schlauch zurück in das Loch drücken.

Bringen Sie den heißen Ort auf etwa 70 °C.

Führen Sie die Sauerstoffplasmabehandlung eines sauberen Glasobjektträgers durch.

HINWEIS: Plasmabehandeltes Glas verliert in der Atmosphäre allmählich seine Reaktivität und sollte so schnell wie möglich, idealerweise innerhalb von Minuten, verwendet werden.

Bewegen Sie den Objektträger auf die Heizplatte.

HINWEIS: Vermeiden Sie es, die zu verklebende Oberfläche zu berühren.

Lassen Sie das Gerät vorsichtig auf den Objektträger fallen. 20–30 s auf der heißen Platte stehen lassen. Klopfen Sie leicht auf die Oberseite des Epoxidharzes, um sicherzustellen, dass das Gerät auf dem Glas liegt und keine Luftblasen vorhanden sind. Bei zu starkem Druck können die Kanäle zusammenbrechen. Verklebte Geräteteile sind von oben sichtbar.

Überprüfen Sie mithilfe einer Lichtquelle hinter sich die Spiegelung des Glases auf Luftblasen. Teile, die mit dem Glas verklebt sind, sind dunkler als die nicht verklebten Bereiche. Die meisten können herausgenommen werden, indem der Chip fest in den Objektträger direkt über der Blase gedrückt wird. Beachten Sie, dass dünne Wände und Kanäle auch hier leicht zusammenbrechen können, wenn das Gerät zu stark gedrückt wird.

HINWEIS: Dieser Schritt ist für Kanäle mit hohem Seitenverhältnis anspruchsvoller und erfordert möglicherweise Übung.

Lassen Sie das neue mikrofluidische Gerät aus Epoxidharz 24 Stunden lang ruhen, um es vollständig auszuhärten, bevor Sie es für Experimente verwenden. Die Geräte können während der Aushärtung und nach Abschluss des gesamten Verfahrens bei Umgebungstemperatur gelagert werden.

Die im Rahmen dieser Studie gesammelten Daten sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Die Autoren danken Jon Edd, Kaustav Gopinathan und Li Zhan für ihr Feedback zu diesem Protokoll.

Die Finanzierung erfolgte durch die National Institutes of Health, USA (1K99AI167063 und R01CA260304).

Zentrum für Ingenieurwissenschaften in Medizin und Chirurgie, Massachusetts General Hospital, Boston, MA, USA

Carlie Rein, Mehmet Toner & Deep Lovers

Harvard Medical School, Boston, MA, USA

Mehmet Toner & Deep Lovers

Shriners Hospital for Children, Boston, MA, USA

Mehmet Toner & Deep Lovers

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CR und DS führten Experimente durch. MT und DS konzipierten und gestalteten Experimente. CR und DS erstellten Zahlen und verfassten das Manuskript. Alle Autoren haben das Manuskript überprüft und überarbeitet.

Korrespondenz mit Deep Lovers.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Rein, C., Toner, M. & Sevenler, D. Rapid Prototyping für Hochdruck-Mikrofluidik. Sci Rep 13, 1232 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-28495-2

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Eingegangen: 28. November 2022

Angenommen: 19. Januar 2023

Veröffentlicht: 22. Januar 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-28495-2

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