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Jun 03, 2023

Hoher Durchsatz, Etikett

Band Nature Communications

Nature Communications Band 13, Artikelnummer: 3385 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Extrem seltene Cluster zirkulierender Tumorzellen (CTC) werden sowohl zunehmend als hochgradig metastatische Vorläufer geschätzt und sind praktisch unerforscht. Technologien sind in erster Linie darauf ausgelegt, einzelne CTCs zu erkennen, berücksichtigen jedoch häufig nicht die Fragilität von Clustern oder nutzen Cluster-spezifische Marker für eine höhere Empfindlichkeit. Unterdessen mangelt es den wenigen Technologien, die auf CTC-Cluster abzielen, an Skalierbarkeit. Hier stellen wir die Cluster-Wells vor, die die Geschwindigkeit und Praktikabilität der Membranfiltration mit dem empfindlichen und deterministischen Screening von Mikrofluidik-Chips kombinieren. Die >100.000 Mikrowells in den Cluster-Wells halten CTC-Cluster im unverarbeiteten Vollblut physisch fest, isolieren praktisch alle Cluster sanft bei einem Durchsatz von >25 ml/h und ermöglichen die Entnahme lebensfähiger Cluster aus dem Gerät. Mit den Cluster-Wells isolierten wir CTC-Cluster mit 2 bis 100+ Zellen von Prostata- und Eierstockkrebspatientinnen und analysierten eine Teilmenge mittels RNA-Sequenzierung. Die routinemäßige Isolierung von CTC-Clustern wird die Forschung zu ihrem Nutzen bei der Krebsbehandlung demokratisieren.

Einzelne zirkulierende Tumorzellen (CTCs), die aus dem Blutkreislauf von Krebspatienten gewonnen werden, liefern wertvolle Informationen über das Stadium der Erkrankung1, ermöglichen eine minimalinvasive Prognose und Diagnose2,3,4, verbessern unser Verständnis der Metastasierung auf zellulärer Ebene5,6 und bieten die Potenzial zur Verbesserung des klinischen Managements von Krebs7,8. Zusätzlich zu diesen einzelnen CTCs sind seit den 1950er Jahren CTC-Aggregate, die im Umlauf bleiben, von großem wissenschaftlichen und klinischen Interesse. Obwohl diese CTC-Cluster oder zirkulierenden Tumor-Mikroembolien äußerst selten sind (schätzungsweise nur 2–5 % aller CTCs), sind sie bei der Bildung von Metastasen überproportional effizient. Aufgrund ihrer geringeren Apoptoserate und der verringerten verlängerten Überlebenseigenschaften9,12 wird ihre Metastasierungsneigung schätzungsweise 100-mal höher sein als die einzelner CTCs9,10,11. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass eine Untergruppe der von Patienten stammenden CTC-Cluster Immunzellen des Wirts umfasst13,14, was den Nutzen dieser metastatischen Vorläufer hervorhebt, um Aufschluss über die Wechselwirkungen zwischen Tumor und Immunsystem und ihre Rolle bei der Metastasierung zu geben. Beispielsweise wurde gezeigt, dass CTC-Cluster, die Neutrophile tragen, bei Patientinnen mit fortgeschrittenem Brustkrebs ein erhöhtes Metastasierungspotenzial haben14, wobei die Neutrophilen-assoziierten CTCs höhere Expressionsniveaus des Proliferationsmarkerproteins (Ki67) und von Genen aufweisen, die mit dem Fortschreiten des Zellzyklus assoziiert sind. Klinische Studien haben die Ergebnisse dieser biologischen Untersuchungen gestützt und festgestellt, dass das Vorhandensein von CTC-Clustern mit einem kürzeren progressionsfreien Überleben und einem kürzeren Gesamtüberleben des Patienten verbunden ist15. Die verstärkte Untersuchung von CTC-Clustern bietet daher große Aussichten auf ein besseres Verständnis und Management von Metastasen.

Bisher war die zuverlässige und effiziente Isolierung lebensfähiger CTC-Cluster begrenzt, da die Empfindlichkeit und Spezifität der CTC-Isolierungstechnologien in erster Linie auf den Nachweis einzelner Zellen kalibriert sind16,17,18,19. Beispielsweise werden Mikrofiltrationstechniken aufgrund ihrer schnellen und unkomplizierten Durchführung häufig als CTC-Assays eingesetzt16,19,20. Allerdings können sich CTC-Cluster unter physiologischem Druck in einzelne kettenartige Strukturen reorganisieren und Verengungen von nur 5 μm11 überwinden, was darauf hindeutet, dass Aggregate angesichts der viel höheren Drücke, die bei der Filtration angewendet werden, wahrscheinlich durch Filterporen gelangen können. Darüber hinaus könnten höhere Scherkräfte, die während der Mikrofiltration auftreten, CTC-Cluster beschädigen oder sie in einzelne Zellen auflösen21, was eine effiziente Anreicherung untergräbt. Andererseits können Antikörper-basierte Anreicherungssysteme, die seit langem zur Isolierung einzelner CTCs17,22,23 verwendet werden, aufgrund ihrer Abhängigkeit von spezifischen Membranantigenen13 nur eine ausgewählte Subpopulation von CTC-Clustern innerhalb der heterogenen CTC-Population erkennen ,24. Darüber hinaus wirkt sich das geringere Verhältnis von Oberfläche zu Volumen von CTC-Clustern negativ auf die Immunocapture-Effizienz antikörperbasierter Technologien aus25 und macht sie für die CTC-Cluster-Anreicherung besonders ineffizient. Vielversprechender in dieser Hinsicht sind neuere mikrofluidische Chips, die speziell auf CTC-Cluster abzielen und relativ höhere Empfindlichkeiten erreichen können. Leider geschieht dies entweder bei klinisch nicht durchführbaren Verarbeitungsraten21,26 oder unter der Gefahr einer Clusterschädigung aufgrund der hohen Flussraten in engen Kanälen27 – ein Problem, das besonders für große Cluster relevant ist, von denen berichtet wurde, dass sie gelegentlich aus bis zu zehn Clustern bestehen von Tumorzellen28.

Um diese Einschränkungen bei der Isolierung und Untersuchung von CTC-Clustern zu beseitigen, haben wir die Cluster-Wells entwickelt. Dieses hochempfindliche Polymergerät mit hohem Durchsatz isoliert sanft kleine und große CTC-Cluster aus unverarbeiteten Vollblutproben, ohne dass auf tumorspezifische Antigene abgezielt werden muss. Stattdessen halten die Cluster-Wells CTC-Cluster in Mikrowells zurück, die so konstruiert sind, dass sie Zellaggregate physisch erkennen und ihre Integrität bei subphysiologischen Flussraten bewahren. Darüber hinaus ermöglicht der uneingeschränkte Zugang zu gereinigten CTC-Clustern in Mikrowells weitere Untersuchungen mittels Bildgebung sowie funktioneller und molekularer Tests.

Die Cluster-Wells fangen CTC-Cluster in Mikrowells ein, die Zellaggregate zurückhalten und gleichzeitig für einzelne Zellen im Blut durchlässig sind (Abb. 1a). Am Boden jeder Vertiefung befindet sich ein Mikronetz mit Öffnungen von 15 μm × 15 μm, einer Größe, die Leukozyten, Erythrozyten und Blutplättchen ungehindert passieren lässt. Somit fließt unbearbeitetes Vollblut problemlos durch das Gerät, aber CTC-Cluster, die zu groß sind, um in eine einzelne Öffnung gesteckt zu werden, werden erfasst, wenn einzelne Zellen innerhalb des Clusters in benachbarten Netzöffnungen stecken bleiben. Sobald sich die CTC-Cluster in einem Bohrloch befinden, werden sie durch schräge Seitenwände auf dem Netz festgehalten, was eine mögliche Neuausrichtung während des Durchflusses einschränkt und die Zellen vor den schädlichen Querspannungen herkömmlicher Membranfilter schützt.

a Schematische Darstellung des Funktionsprinzips des Cluster-Wells. Während einzelne Zellen ungehindert passieren, erfasst der Cluster-Wells CTC-Cluster aufgrund ihrer vielzelligen Morphologie aus Blutproben von Krebspatienten, unabhängig von der Krebsart und ihrem molekularen Charakter. b Ein Foto der Cluster-Wells, hergestellt in Form einer Membran mit 47 mm Durchmesser, zur Verwendung in kommerziellen Filterhaltern. Das Nahaufnahmebild (Einschub) zeigt einzelne Vertiefungen, die für die Erfassung von CTC-Clustern konzipiert sind. (Rechts) Rasterelektronenmikroskopaufnahme eines mit Blut versetzten LNCaP-Clusters, aufgenommen von einer der Vertiefungen des Geräts (siehe „Methoden“: SEM-Probenvorbereitung und Bildgebung). Maßstabsbalken, 20 μm. c Schematische Darstellung des Herstellungsprozesses, der zum Formen des Polymer-Cluster-Wells-Geräts entwickelt wurde. Die in der Abbildung gezeigten Schritte schließen den Herstellungsprozess für die Silikonform und die Konstruktion einer wiederverwendbaren PDMS-Form aus, die in den ergänzenden Abbildungen zu finden sind. 2 und 3. Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen der PDMS-Struktur, die für das Mikroformen verwendet wurde (unten rechts) und des fertigen Geräts, hergestellt aus dem photohärtbaren Polymer MD700 (unten links). Maßstabsbalken, 50 μm.

Die Netzlinien sind so konzipiert, dass sie dünn sind (ca. 2 μm breit), sodass sie als Keil zwischen den Zellen fungieren, Clusterzellen in verschiedene Öffnungen zwingen und den Cluster an Zell-Zell-Verbindungen festhalten. Um eine Cluster-Dissoziation durch Netzlinien zu verhindern, wurde die Zellflussgeschwindigkeit auf nur 65 μm/s eingestellt (ergänzende Abbildung 1), was etwa 10-mal niedriger ist als die physiologische Geschwindigkeit des freien Flusses in menschlichen Kapillaren29. Um eine schonende Handhabung der CTC-Cluster zu gewährleisten und gleichzeitig klinisch relevante Durchsatzraten zu erreichen, haben wir eine große Anzahl von Cluster-Trapping-Bohrlöchern parallel betrieben. Selbst bei der angegebenen Flussrate lieferten 120.000 Mikrowells, die gleichmäßig über eine Membran mit 47 mm Durchmesser verteilt waren, eine Verarbeitungsrate von 25 ml/h (Abb. 1b).

Wir haben die Cluster-Wells als Einweg-Polymergerät konzipiert, um eine schnelle und kostengünstige Herstellung zu gewährleisten und die Technologie in einer Vielzahl von Forschungs- und klinischen Umgebungen zugänglich zu machen. Der Mikrofabrikationsprozess kombinierte Silizium-Mikrobearbeitung30, Soft-Lithographie31 und Mikroformtechniken32 (siehe „Methoden“: Mikrofabrikation der Silizium-Masterform und Formen der Cluster-Wells aus der Silizium-Masterform). Wir haben zunächst eine Negativform aus Silizium mithilfe eines 3-Masken-Mikrofabrikationsprozesses hergestellt, der die Abscheidung dünner Filme mit Nass- und reaktiven Ionenätzschritten umfasste (ergänzende Abbildung 2). Anschließend wurde die Silikonform in Polydimethylsiloxan (PDMS) überführt und mittels Softlithographie repliziert. Die resultierende negative PDMS-Form wurde mit einem photohärtbaren Polymer (Fluorolink MD700, Solvay) gefüllt und in der Form vernetzt, um das Gerät zu bilden (Abb. 1c). Das hergestellte Gerät war 65 μm dick und strukturell starr, was eine einfache Handhabung ermöglichte. Dieser Prozess ermöglicht es uns, die komplizierte Geometrie, die nur mit der Silizium-Mikrobearbeitung erreichbar ist, auf erschwingliche Einweg-Kunststoffgeräte zu übertragen.

Um den Betrieb von Cluster-Wells zu testen und zu optimieren, haben wir Proben verarbeitet, die durch Zugabe von künstlich gebildeten Clustern menschlicher Krebszelllinien in Blutproben gesunder Spender gemäß einem vom IRB genehmigten Protokoll hergestellt wurden (siehe „Methoden“: Zellkultur und -vorbereitung & Beispielsammlung). In diesen Experimenten wurden Tumorzellcluster zur positiven Identifizierung entweder vor- oder nachträglich mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert. Mit Clustern versetztes Vollblut wurde durch Cluster-Wells in einem handelsüblichen Filterhalter geleitet, gefolgt von einem Waschen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und einer Immunfluoreszenzfärbung der Zellen auf dem Gerät. Die eingefangenen Cluster wurden in Mikrovertiefungen mittels Fluoreszenzmikroskopie identifiziert (Abb. 2a).

a Repräsentative Fluoreszenzbilder eines erfassten LNCaP-Clusters, versetzt in unverarbeitetes Vollblut. Nach dem Waschen und Fixieren mit PBS wurden die isolierten Tumorzellen mit Cytokeratin (grün) und DAPI (Kerne, blau) gefärbt. Maßstabsbalken, 20 μm. b Schematische Darstellung des Versuchsaufbaus, der für die Charakterisierungsstudien verwendet wurde. Die Zellen, die in die analytischen Versionen der Cluster-Wells ein- und austreten, wurden visuell verfolgt und für Berechnungen der Einfangeffizienz mithilfe einer 2-Kanal-Mikrofluidschnittstelle gezählt (siehe „Methoden“: Messung der Geräteempfindlichkeit). c Cluster-Erfassungseffizienz für die aufgestockten LNCaP-Cluster bei unterschiedlichen Flussraten. Die Daten werden entsprechend der Anzahl der Zellen in Clustern bereitgestellt (n = 3 unabhängige Experimente). Die Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt. d Zwei-Zell-Cluster-Erfassungsraten für Prostata- (LNCaP), Brust- (MDA-MB-231 und MCF-7) und Eierstockkrebs-Zellcluster (HeyA8) bei einer Flussrate von 25 ml/h (n = 3 unabhängige Experimente) . Die Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt. Da die Cluster-Wells ausschließlich auf den physikalischen Eigenschaften von Clustern basieren, wurden Cluster verschiedener Tumortypen unabhängig von ihren Oberflächenantigenen effizient erfasst. e Zwei-, drei- und vierzellige LNCaP-Cluster-Erfassungseffizienzen für Geräte mit unterschiedlichen Öffnungsgrößen (n = 3 unabhängige Experimente). Die Experimente wurden mit einer Durchflussrate von 25 ml/h durchgeführt. Die Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt. f Retentionsraten weißer Blutkörperchen (WBC) für Geräte mit unterschiedlichen Öffnungsgrößen nach Verarbeitung eines Röhrchens (10 ml) mit unverarbeitetem Vollblut (n = 3 unabhängige Experimente). Die unspezifisch gebundenen WBCs wurden gefärbt und gezählt. Zur Berechnung der Retentionsrate wurde die ermittelte Leukozytenzahl durch die Gesamtzahl der durch das Gerät gelaufenen Leukozyten dividiert, die von einem vollständigen Blutbildanalysator (CBC) erfasst wurde. Die Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Um die Einfangeffizienz der Cluster-Wells bei verschiedenen Durchflussraten zu bestimmen, haben wir die mit Spikes versehenen Clusterpopulationen, die in das Gerät ein- und austreten, abgebildet und verglichen. Wir haben eine 2-Kanal-Mikrofluidik-Schnittstelle entwickelt, um jeden verarbeiteten Cluster unter einem Mikroskop abzubilden, was es uns ermöglichte, gleichzeitig fluoreszierende Krebszellen im Vollblut während ihres Ein- und Austritts im selben Sichtfeld zu verfolgen (Abb. 2b) (siehe „Methoden“) : Messung der Geräteempfindlichkeit). Für diese Experimente haben wir Zellkerne anstelle von Zellmembranen oder Zytoplasma gefärbt, um eine bessere visuelle Unterscheidung zwischen Zellen zu ermöglichen und eine genauere Zählung von Zellen innerhalb von Clustern zu ermöglichen. Darüber hinaus wurde die Bildgeschwindigkeit hoch genug eingestellt, um (1) mehrere (>4) Aufnahmen jedes Clusters zu sichern, um sicherzustellen, dass keiner der Cluster übersehen wurde, und (2) mehrere unterschiedliche Konformationen im Sichtfeld zu erfassen, was die Genauigkeit des Clusters erhöht Größenschätzung. Wir haben den optimierten Charakterisierungsaufbau validiert (siehe „Methoden“: Messung der Geräteempfindlichkeit), indem wir die 2-Kanal-Mikrofluidikschnittstelle in einer Schleife ohne angeschlossenes Gerät betrieben haben, um zu bestätigen, dass im System kein Zellverlust aufgetreten ist (Ergänzungstabelle 1) und auch indem sichergestellt wird, dass die mit unserem Setup ermittelten Clusterzahlen mit den direkten Zählungen der erfassten Cluster auf dem Gerät übereinstimmen (ergänzende Abbildung 4).

Mithilfe der Cluster-Wells verarbeiteten wir Vollblutproben, die mit Clustern menschlicher Prostatakrebszellen (LNCaP) versetzt waren, mit Raten im Bereich von 25 bis 750 ml/h (Abb. 2c). Bei 25 ml/h isolierte das Gerät fast alle Cluster, wobei nur etwa 6,8 % der Dubletts fehlten. Bei 250 ml/h, einem Durchsatz, der das Screening eines Röhrchens Vollblut in nur ca. 2 Minuten ermöglicht, flossen die Zellen immer noch mit physiologischer Fließgeschwindigkeit durch die Mikrovertiefungen, und das Gerät erfasste alle Tumorzellcluster, die aus 6 oder mehr Zellen bestanden , ~98,7 % der 5-Zellen-Cluster, ~93,8 % der 4-Zellen-Cluster, ~89,3 % der 3-Zellen-Cluster und ~75,8 % der Dubletts. Nur bei Flussraten > 500 ml/h dissoziierten die mit Spikes versehenen Zellcluster im Gerät, was durch die beobachtete Diskrepanz zwischen den Größenverteilungen der mit Spikes versetzten und verarbeiteten Zellpopulationen belegt wird (ergänzende Abbildung 5).

Um die Empfindlichkeit des Geräts bei der Verarbeitung von Tumorzellclustern verschiedener Krebsarten zu untersuchen, haben wir auch Proben verarbeitet, die mit Clustern von Brustkrebszelllinien (MDA-MB-231 und MCF-7) und Eierstockkrebszelllinien (HeyA8) versetzt waren. Diese Tumorzellen weisen andere biochemische und biophysikalische Eigenschaften als die zuvor getesteten Prostatakrebszellen sowie Unterschiede in der Zell-zu-Zell-Affinität auf. Dennoch erfassten die Cluster-Wells bei 25 ml/h 90 % oder mehr der Dubletts, den am weitesten verbreiteten Clustertyp, für alle Tumorzelllinien, was die Anwendbarkeit dieser Technologie auf Krebsarten verschiedener Gewebe unterstützt (Abb. 2d). Um die gemessene Empfindlichkeit des Geräts ins rechte Licht zu rücken: Der Cluster-Wells erfasst Dubletts mit der doppelten berichteten Empfindlichkeit eines Cluster-Chips ähnlicher Größe21, ein Gerät, das sich bereits als empfindlicher für die Erfassung von Clustern erwiesen hat als Techniken, die für einzelne CTCs optimiert sind , während das Blut 10-mal schneller untersucht wird (ergänzende Abbildung 6). Wenn beide Plattformen Proben mit der gleichen Durchflussrate (50 ml/h) screenen, erfasst der Cluster-Wells tatsächlich die kleinsten Cluster mit einer Effizienz, die fast eine Größenordnung (~9x) höher ist, basierend auf den veröffentlichten Erfassungsraten21 des Clusters -Chip. Selbst beim Screening von Vollblut mit einem Durchsatz von 100 ml/h ist die Cluster-Wells-Methode empfindlicher als jede CTC-Cluster-Anreicherungsmethode und übersieht nur etwa 10,4 % der Dubletts und etwa 2,7 % der Tripletts.

Um die Gerätegeometrie für die CTC-Cluster-Isolierung zu optimieren, untersuchten wir den Einfluss der Mikromaschenöffnungsgröße auf die Geräteleistung. Zusätzlich zu den in diesem Artikel beschriebenen Cluster-Wells haben wir eine Version mit kleineren (13,5 μm) Öffnungen und eine weitere mit größeren (16,5 μm) Öffnungen entworfen. Bei erneuten Tests mit Vollblut, das mit menschlichen Prostatakrebszellen (LNCaP) angereichert war, stellten wir fest, dass die angepassten Öffnungsgrößen einen Kompromiss zwischen Cluster-Capture-Sensitivität und -Spezifität darstellten. Während jedes bei 25 ml/h getestete Gerät alle größeren Cluster (4+ Zellen) erfassen konnte, führte ein 16,5-μm-Netz zu einer Verringerung der Dublett-Erfassungseffizienz um ca. 20 % und einer Verringerung der 3-Zellen-Cluster um ca. 2,5 % Erfassung (Abb. 2e). Umgekehrt erhöhte die Verringerung der Öffnung auf 13,5 μm die Dublett-Einfangeffizienz um ca. 5 %, was einer Gesamteinfangrate von ca. 98 % entspricht. Die kleinere Netzöffnung verringerte jedoch auch die Spezifität und ermöglichte im Durchschnitt eine um etwa 60 % höhere Leukozytenkontamination (Abb. 2f). Da die meisten Leukozyten jedoch nicht mechanisch eingefangen werden, sondern unspezifisch an zufälligen Stellen an Oberflächen haften, führte die Vergrößerung der Maschenöffnungen zu geringeren Spezifitätsgewinnen: Größere Maschenöffnungen (16,5 μm) verringerten die Leukozytenkontamination nur um etwa 20 %. Unter Berücksichtigung der gesammelten Reinheits- und Einfangeffizienzdaten haben wir die 15-μm-Maschenöffnung als optimale Designwahl identifiziert, die eine durchschnittliche Kontamination von ~28,8 weißen Blutkörperchen (WBC)/mm2 (<0,06 %) zusammen mit ~331 Blutplättchen ergab /mm2 (<0,025 %) aus der Verarbeitung einer 10 ml unmanipulierten Vollblutprobe in unseren Tests.

Da die Freisetzung lebensfähiger CTC-Cluster für nachgelagerte molekulare und funktionelle Tests von entscheidender Bedeutung ist, haben wir die Cluster-Wells aus einem fluorbasierten Polymer mit niedriger Oberflächenenergie (Fluorolink MD700, Solvay) gebaut, um die Cluster-Rückgewinnung durch Minimierung unspezifischer Zelladhäsion zu verbessern, wie dokumentiert Nachteil bei PDMS-basierten Geräten21. Um die Freisetzungsleistung der Cluster-Wells zu beurteilen, haben wir versucht, lebensfähige Tumorzellcluster abzurufen, die auf dem Gerät erfasst wurden (Abb. 3a). Nach der Verarbeitung von mit LNCaP-Clustern versetzten Vollblutproben mit 25 ml/h wuschen wir die Cluster-Wells mit PBS und gaben die Cluster bei unterschiedlichen Rückflussgeschwindigkeiten in Petrischalen ab. Mithilfe der Fluoreszenzmikroskopie identifizierten wir sowohl die Cluster, die erfolgreich in der Sammel-Petrischale freigesetzt wurden, als auch diejenigen, die bei jeder getesteten Geschwindigkeit auf dem Gerät verblieben, und berechneten die Effizienz der Clusterfreisetzung, um die optimale Rückflussgeschwindigkeit zu bestimmen. Die Freisetzungseffizienz nahm mit höheren Rückflussgeschwindigkeiten zu, wodurch mehr unspezifisch am Gerät anhaftende Cluster verdrängt wurden. Wir kamen zu dem Schluss, dass bei einer durchschnittlichen Rückflussrate von ~6,5 mm/s innerhalb der Mikrowells (100-fache der Fangflussgeschwindigkeit) für ~10 Sekunden fast alle (~96 %) der Cluster erfolgreich geborgen werden konnten (Abb. 3b). . Darüber hinaus bestätigten wir, dass die Integrität der freigesetzten Cluster erhalten blieb, indem wir die Größen der eingefangenen und freigesetzten Clusterpopulationen direkt verglichen (ergänzende Abbildung 7).

eine Darstellung des Freigabevorgangs. LNCaP-Cluster wurden in Vollblut gegeben und mit Cluster-Wells verarbeitet. Nach dem Waschen mit PBS wurden die eingefangenen Cluster durch Anwendung eines Rückflusses in eine Petrischale freigesetzt. b Freisetzungseffizienz des Geräts bei unterschiedlichen relativen Rückströmungsgeschwindigkeiten. Nach der Freisetzung wurden sowohl die Petrischale als auch das Gerät mit einem Fluoreszenzmikroskop abgebildet und die Zellen wurden manuell gezählt, um die Freisetzungseffizienz zu berechnen (n = 3 unabhängige Experimente). Die Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt. c Prozentuale Lebensfähigkeit der Kontrolle und Cluster, die bei einer Rückflussgeschwindigkeit von 6,5 mm/s in eine Petrischale freigesetzt werden (n = 3 unabhängige Experimente). Der Zweifarben-Lebensfähigkeitstest wurde an den Kontroll- und freigesetzten Zellen in den Petrischalen durchgeführt (siehe „Methoden“: Messung der Zelllebensfähigkeit), die anschließend mit einem Fluoreszenzmikroskop gescannt wurden. Zur Berechnung des Prozentsatzes lebensfähiger Zellen wurde die Anzahl lebensfähiger und toter Zellen gezählt. Die Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt. d Ein Foto der Cluster-Wells und der Kapillare eines Mikromanipulators in einem einzelnen Mikrowell. Im Gegensatz zu mikrofluidischen Geräten könnten einzelne Mikrovertiefungen mithilfe eines Mikromanipulators leicht zugänglich sein. e Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen der Cluster-Wells nach der Entnahme aus dem Filterhalter. Aufgrund der Oberflächenspannung bleibt die zuvor eingebrachte Fluoreszenzfarbstofflösung in den Vertiefungen und der Inhalt einzelner Mikrovertiefungen kann mithilfe eines Mikromanipulators abgerufen werden. Wenn sie unbeaufsichtigt bleiben, trocknen die Mikrowells in ca. 10 Minuten. Maßstabsbalken, 50 μm. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Die gemessene Abrufeffizienz der Cluster-Wells ist höher als die zuvor gemeldete Cluster-Abrufrate des PDMS-basierten Cluster-Chip21. In Anlehnung an die Testbedingungen, die in unseren Experimenten für den Cluster-Chip beschrieben wurden, verwendeten wir die Cluster-Wells zur Verarbeitung von mit MDA-MB-231-Clustern versetzten Blutproben und versuchten, die eingefangenen Aggregate freizusetzen. Unter Verwendung der gleichen Rückströmungsgeschwindigkeit (6,5 mm/s) und Dauer, die zuvor mit dem Cluster-Chip angewendet wurde, konnten wir Cluster aus Cluster-Wells mit mehr als dem Zweifachen (87 % gegenüber 37 %) der Effizienz des Cluster-Chips abrufen (Ergänzende Abbildung 8). Selbst im Vergleich zur berichteten Freisetzungseffizienz eines Cluster-Chips, der bei 4 °C betrieben wurde, um die unspezifische Zelladhäsion am Mikrofluidik-Chip zu reduzieren, zeigten die Cluster-Wells eine höhere Effizienz (87 % Abruf bei den Cluster-Wells gegenüber 80 % bei der Cluster-Chip).

Als nächstes untersuchten wir mithilfe eines Assays mit lebenden/toten Zellen die Lebensfähigkeit von Tumorzellen, die eingefangen und anschließend aus den Cluster-Wells freigesetzt wurden (siehe „Methoden“: Messung der Lebensfähigkeit der Zellen) (Ergänzende Abbildung 9). Für diese Messungen wurden LNCaP-Cluster, die von den Cluster-Wells aus aufgestockten Blutproben eingefangen wurden, unter Rückfluss mit 6,5 mm/s freigesetzt. Es wurde festgestellt, dass die durchschnittliche Lebensfähigkeit der freigesetzten Cluster (~95,8 %) der der Kontrollpopulation (~96,3 %) ähnlich ist, was zeigt, dass weder das Gerät noch das Freisetzungsprotokoll einen deutlichen Einfluss auf die Lebensfähigkeit der Zellen hatten (Abb. 3c).

Um zu beurteilen, ob wir die exponierte Anordnung der Cluster-Wells zur Gewinnung von Zellen nutzen können, haben wir auch untersucht, ob lebensfähige Cluster mithilfe eines Mikromanipulators direkt aus den Mikrowells erfasst werden können (Abb. 3d). Zunächst haben wir getestet, ob eingefangene Cluster sicher in den Mikrovertiefungen zurückgehalten werden konnten, während das Gerät für die Mikromanipulation eingerichtet war. Durch den Vergleich der Anzahl der auf dem exponierten Gerät abgebildeten Cluster mit der Anzahl der mit Spikes versehenen Cluster stellten wir fest, dass die Mehrheit (~95,8 %) der Cluster auf dem exponierten Gerät erhalten blieben. Anschließend führten wir einen separaten Test durch, um festzustellen, ob das Gerät mit seinen porösen Mikrowells vorzeitig austrocknet, sobald es aus dem Filterhalter genommen und freigelegt wird, was die Ansammlung lebensfähiger Cluster verhindern würde. Wir füllten die Cluster-Wells mit einer fluoreszierenden Farbstofflösung und stellten fest, dass die Hydrophobie des Geräts in Kombination mit der Oberflächenspannung verhinderte, dass Flüssigkeit unter Schwerkraft durch das Mikronetz austrat (Abb. 3e). Da die Flüssigkeit über der Oberfläche des freigelegten Geräts verdunstete, trockneten außerdem die Mikrovertiefungen zuletzt, wodurch eine natürliche Isolierung zwischen den Vertiefungen gewährleistet wurde, sodass ihr Inhalt ohne Übersprechen gesammelt werden konnte (Abb. 3e).

Um die potenzielle klinische Anwendung des Geräts zu bewerten, haben wir die Cluster-Wells-Technologie angewendet, um CTC-Cluster aus Blutproben von Patienten mit Eierstock- und Prostatakrebs zu isolieren. Die Blutproben mit einem Volumen von 2,8 bis 24 ml wurden von einwilligenden Patienten gemäß IRB-genehmigten Protokollen an der Emory University und den Northside Hospitals entnommen und innerhalb von 4 Stunden nach der Entnahme am Georgia Tech verarbeitet (siehe „Methoden“: Probenentnahme und Probenahme). wird bearbeitet). Nach der Fixierung isolierter Zellen mit 4 % Paraformaldehyd (PFA) wurden die Proben mit Leukozytenmarkern und gegen etablierte Krebsmarker für die spezifische Krankheit immungefärbt; Eine Kernfärbung (4,6-Diamidino-2-phenylindol) wurde ebenfalls angewendet, um CTC-Cluster bei Patienten eindeutig zu identifizieren (siehe „Methoden“: Immunfluoreszenzfärbung von CTC-Clustern). Anschließend wurden immungefärbte Cluster abgebildet und durch Scannen der Cluster-Wells unter einem Fluoreszenzmikroskop analysiert. Die Spezifität des Assays wurde auch für beide Krebsarten validiert, indem 10 ml gesunde Spenderblutproben (jeweils n = 3) verarbeitet wurden, bei denen bestätigt wurde, dass sie keine CTC-Cluster enthielten.

Wir haben CTC-Cluster sowohl in Blutproben von Patienten mit Eierstockkrebs (Abb. 4a) als auch Prostatakrebs (Abb. 4b) festgestellt. Die Anzahl der Zellen in diesen Clustern reichte von 2 bis zu >150 Zellen, wobei letztere in einer Probe einer Patientin mit Eierstockkrebs gefunden wurden (Abb. 4a, iii). Die überraschend große Größe des isolierten CTC-Clusters bei Eierstockkrebs wirft nicht nur Fragen zur physiologischen Zirkulation von CTC-Clustern auf, sondern weist auch auf einen potenziellen Nachteil mikrofluidischer Chips hin, selbst wenn sie für CTC-Cluster konzipiert sind: Ein CTC-Cluster dieser Größe hätte dies getan Wahrscheinlich verstopften sie enge mikrofluidische Kanäle oder zerfielen in kleinere Stücke, wenn sie durchdrungen wurden. Es wurde auch festgestellt, dass einige der isolierten CTC-Cluster Leukozyten sowohl in Eierstock- als auch in Prostatakrebsproben enthielten (Abb. 4a, ii und b, iii), eine Beobachtung, die mit früheren Berichten über CTC-Cluster bei Brustkrebs übereinstimmt14. Um den physikalischen Zusammenhalt zwischen Zellen in diesen Leukozyten-assoziierten CTC-Clustern zu bestätigen, wurden solche Cluster absichtlich aus den Mikrovertiefungen entfernt und dann wieder eingefangen.

a Fluoreszenzmikroskopische Bilder der isolierten CTC-Cluster von Eierstockkrebspatientinnen. Eingefangene Zellen wurden mit Cytokeratin, Vimentin (grün), CD45 (rot) und DAPI (Kerne, blau) gefärbt. Maßstabsbalken, 20 μm. b Bilder der isolierten CTC-Cluster von Patienten mit metastasiertem Prostatakrebs. Eingefangene Zellen wurden mit Cytokeratin, Vimentin, PSA/KLK3, EpCAM (grün), CD45 (rot) und DAPI (Kerne, blau) gefärbt. Maßstabsbalken, 20 μm. c Cluster, die aus der peripheren Blut- und Aszitesprobe isoliert wurden, die zum gleichen Zeitpunkt aus der Bauchhöhle einer Patientin mit Eierstockkrebs entnommen wurde. Der isolierte CTC-Cluster unterschied sich morphologisch von den Tumorsphäroiden, die aus einer Aszitesprobe desselben Patienten isoliert wurden. Die Sphäroide aus der Aszitesprobe wurden fixiert und mit Cytokeratin, EpCAM (rot), CD45 (grün) und DAPI (Kerne, blau) gefärbt, und aus der Blutprobe isolierte CTC-Cluster wurden fixiert und mit Cytokeratin, Vimentin (grün) und CD45 gefärbt ( rot) und DAPI (Kerne, blau). Maßstabsbalken, 20 μm. d Prozentsatz der Patienten mit Prostata- (n = 8) und Eierstockkrebs (n = 9), bei denen in ihren Blutproben CTC-Cluster beobachtet wurden. e Anzahl der beobachteten CTC-Cluster pro Milliliter Blutproben von Patienten mit Prostata- und Eierstockkrebs. f Verteilung der Anzahl der in den CTC-Clustern der Prostata und der Eierstöcke beobachteten Zellen. Die Boxplots zeigen das 25. und 75. Perzentil, die Linie zeigt den Median und die Whiskers zeigen Maxima- und Minimapunkte. g Prozentsatz der mit reinen und weißen Blutkörperchen assoziierten CTC-Cluster für jeden Krankheitstyp. h Bilder der CTC-Cluster, die von einer Patientin mit Eierstockkrebs isoliert und einem fluoreszenzbasierten Lebensfähigkeitstest unterzogen wurden. Die Bilder zeigen CTC-Cluster, die (i) sowohl aus lebenden als auch aus toten (gelben) Zellen und (ii) nur aus lebenden Zellen bestanden. Maßstabsbalken, 20 μm. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Um die Anwendbarkeit der Cluster-Wells bei der Isolierung von Zellaggregaten aus anderen Körperflüssigkeiten als Vollblut zu testen, haben wir versucht, Tumorsphäroide aus einer Aszitesprobe einer Patientin mit Eierstockkrebs zu isolieren (siehe „Methoden“: Probenverarbeitung). Die in der Aszitesprobe beobachtete Konzentration von Tumorzellsphäroiden war deutlich höher im Vergleich zu der von CTC-Clustern, die in einer peripheren Blutprobe beobachtet wurden, die vom selben Patienten zum gleichen Zeitpunkt entnommen wurde (~1500 Sphäroide/ml gegenüber 0,167 CTC-Cluster/ml). Darüber hinaus wurde beobachtet, dass Tumorzellen in isolierten Sphäroiden morphologisch größer waren als diejenigen in CTC-Clustern, die wir aus der Blutprobe isoliert hatten (Abb. 4c und ergänzende Abb. 10).

In der von uns untersuchten Patientenkohorte (Ergänzungstabellen 2 und 3) wurden CTC-Cluster bei 6/8 Patienten mit Prostatakrebs und bei 8/9 Patienten mit Eierstockkrebs festgestellt (Abb. 4d). Die Anzahl der erkannten CTC-Cluster variierte stark zwischen den Patienten, wobei die Konzentrationen bei Patienten mit Prostatakrebs zwischen 0,063 und 0,867 Clustern/ml und bei Patienten mit Eierstockkrebs zwischen 0,167 und 59,2 Clustern/ml lagen (Abb. 4e). Im Durchschnitt bestanden CTC-Cluster für Eierstockkrebs aus mehr Tumorzellen als CTC-Cluster für Prostatakrebs, mit einem Median von 6 Zellen gegenüber 3 Zellen bei Prostatakrebs (Abb. 4f). Darüber hinaus enthielten 26,4 % der isolierten CTC-Cluster bei Eierstockkrebs Leukozyten, während 16,4 % der CTC-Cluster bei Prostatakrebs Leukozyten enthielten (Abb. 4g). Insgesamt zeugt die beobachtete phänotypische Heterogenität in den durch Cluster-Wells isolierten CTC-Clustern vom hohen Dynamikbereich und den schonenden Verarbeitungsbedingungen, die die Technik bietet. Auch eine höhere Konzentration (0,43/ml vs. 0,28/ml21) von Prostatakrebs-Clustern, die von den Cluster-Wells im Vergleich zum Cluster-Chip erkannt wurden, wenn auch in unterschiedlichen Kohorten, könnte möglicherweise auf die überlegene Isolationseffizienz der Cluster-Wells zurückzuführen sein , angesichts der geringen Größe der CTC-Cluster bei Prostatakrebs.

Wichtig ist, dass CTC-Cluster in der Patientenkohorte mit Eierstockkrebs mit einer durchschnittlichen Konzentration von 10,32 Clustern/ml deutlich häufiger vorkamen. Das häufige Auftreten von CTC-Clustern bei Patientinnen mit Eierstockkrebs, insbesondere vor dem Hintergrund früherer Studien zu einzelnen CTCs bei Eierstockkrebs33, deutet auf eine hocheffiziente Intravasationsfähigkeit von Eierstockkrebszellen hin. Darüber hinaus stellten wir bei der Untersuchung der Lebensfähigkeit von CTC-Clustern einer der Eierstockkrebspatientinnen fest (siehe „Methoden“: Bewertung der Lebensfähigkeit von aus Patientenproben isolierten CTC-Clustern), dass die durch Cluster-Wells isolierten CTC-Cluster lebensfähige Tumorzellen enthielten ( Abb. 4h), die die Vorteile der schnellen und dennoch schonenden Anreicherung durch die Technologie noch deutlicher hervorhob. Insgesamt könnte die Isolierung lebensfähiger CTC-Cluster daher besonders nützlich für die Diagnose und Überwachung von Eierstockkrebs sein34.

Um die Machbarkeit der Verwendung von Cluster-Wells zur Isolierung lebensfähiger CTC-Cluster für nachfolgende molekulare Tests zu demonstrieren, führten wir eine RNA-Sequenzierung an einzelnen CTC-Clustern von zwei Prostatakrebspatienten durch (siehe „Methoden“: Vorbereitung und Sequenzierung der RNA-Bibliothek und Datenanalyse der RNA-Sequenzierung). Nicht fixierte Zellen auf den Cluster-Wells wurden zunächst gegen tumorspezifische Membranantigene und Leukozytenmarker immungefärbt, und fluoreszierende CTC-Cluster wurden zur Sequenzierung mithilfe eines Mikromanipulators direkt aus den Mikrowells entnommen (Abb. 5a) (siehe „Methoden“: Mikromanipulation von CTC-Clustern aus Patientenproben). Da die Proben für molekulare Studien einem anderen Färbeprotokoll unterzogen wurden, das ausschließlich auf Oberflächenmarker abzielte (Abb. 5b), wurden sie nicht in die Zählung von CTC-Clustern bei Prostatakrebspatienten einbezogen.

a Mikromanipulation eines CTC-Clusters, der aus der Blutprobe eines Patienten mit metastasiertem Prostatakrebs (Patient-1) isoliert wurde. Nach der Blutfiltration und PBS-Waschung wurden isolierte lebensfähige CTC-Cluster auf dem Gerät mit FITC-konjugierten Antikörpern gegen EpCAM und Prostata-spezifischem Membranantigen (PSMA) gefärbt, mit einem Fluoreszenzmikroskop gescannt und direkt vom Gerät aus mikromanipuliert. Maßstabsbalken, 50 μm. b Repräsentative Fluoreszenzmikroskopbilder der Prostata-CTC-Cluster, die RNA-Seq unterzogen werden. Die Bilder wurden aufgenommen, bevor sie zur molekularen Analyse vom Gerät abgerufen wurden. Maßstabsbalken, 20 μm. c t-verteiltes stochastisches Nachbareinbettungsdiagramm (t-SNE) der sequenzierten Patientencluster, Prostatakrebszelllinien und weißen Blutkörperchen. d Heatmap-Diagramm, das die Expressionsniveaus ausgewählter Gene in isolierten CTC-Clustern von zwei Patienten mit metastasiertem Prostatakrebs, Prostatakrebs-Zelllinien und weißen Blutkörperchen veranschaulicht. RPM-Lesevorgänge pro Million.

Insgesamt wurden 6 CTC-Cluster von zwei Prostatakrebspatienten sowie zwei Leukozytensätze und jeweils zwei Cluster von LNCaP- und PC-3-Prostatakrebszelllinien sequenziert. Aus den Patientenclustern erhielten wir einen Median von 83,15 M Reads pro Probe, mit einem Median von 74 M eindeutig zugeordneten Reads (~88,8 %) und einem durchschnittlichen Phred-Score von 36 für die mittlere Sequenzqualität. Wir haben insgesamt 16.412 eindeutige Transkripte entdeckt und den gesamten Satz erkannter Transkripte verwendet, um eine t-SNE-Analyse durchzuführen, um die Patientencluster mit den Kontroll-WBCs und Prostatakrebszelllinien zu vergleichen (Abb. 5c) und beobachteten, dass sich unterschiedliche Cluster aus denselben bildeten Patient oder Zelllinie neigten dazu, sich zusammenzuballen.

Zuerst führten wir eine DESeq2-Analyse durch,35 indem wir die Patientencluster mit den Leukozyten verglichen, um unterschiedlich exprimierte Transkripte zu identifizieren, und identifizierten insgesamt 3718 Transkripte (p-adj < 0,01). Die gesamte Rangliste der erkannten Transkripte wurde für die Gen-Set-Anreicherungsanalyse36 mit WebGestalt37 verwendet und wir beobachteten zahlreiche hochsignifikante Gen-Sets, die in den Patientenclustern angereichert waren, darunter MYC-Zielgene, G2M-Checkpoint-Gene, E2F-Ziel- und Östrogen-Reaktionsgene (Ergänzende Abbildungen). 12 und 13) aus den Hallmark 50-Gensätzen und den KEGG-Signalweg-Gensatzsammlungen. Diese Gensätze stehen im Einklang mit proliferativen, hormonell gesteuerten Zellen wie bösartigen Tumorzellen38,39,40. Darüber hinaus waren die Patientencluster negativ angereichert in Bezug auf immunzellbezogene Gensätze wie Gene für die Zytotoxizität natürlicher Killerzellen, Gene für die Transplantat-gegen-Wirt-Krankheit, Gene für die Interferon-Gamma-Reaktion und Th1/Th2-Differenzierungsgene, was darauf hindeutet, dass das Transkriptom von Diese Cluster unterschieden sich von gesunden Immunzellen des Wirts (ergänzende Abbildung 14).

Die Analyse von Transkripten, die einem ausgewählten Satz von Genen für Prostatakrebs entsprechen, zeigte, dass alle CTC-Cluster hohe Mengen an Epithelmarkern exprimierten (Abb. 5d). Unter den Epithelmarkern waren Epithelial Cell Adhesion Molecule (EpCAM), E-Cadherin (CDH1) und Cytokeratin (KRT) 8, 18 und 19 in allen CTC-Clustern stark exprimiert, insbesondere aber auch in den CTC-Clustern von Patient-2 ausgedrückt KRT5. Unter den mesenchymalen Markern wurde Vimentin (VIM), ein Hinweis auf die Induktion des Übergangs vom Epithel zum Mesenchym (EMT)41, von den meisten CTC-Clustern in relativ geringeren, aber nachweisbaren Mengen exprimiert. Zusätzlich zu etablierten Tumormarkern wurden Patientengruppen auch auf Stammzell- und proliferationsassoziierte Marker untersucht. Unter den Stammzellmarkern wurde CD24 in allen CTC-Clustern in unterschiedlichen Mengen exprimiert, während bei 5/6 Clustern hohe Mengen (>50 U/min) an CD44 exprimiert wurden. Es wurde bereits früher berichtet, dass homophile CD44-Wechselwirkungen und nachfolgende CD44-PAK2-Wechselwirkungen die Aggregation von Tumorzellen42 vermitteln und die Stammzellenstabilität, das Überleben und das Fortschreiten der Metastasierung verbessern43,44. In ähnlicher Weise exprimierten alle CTC-Cluster hohe Mengen an TIMP1, JUN und FOS, von denen bekannt ist, dass sie die Zellproliferation stimulieren, die Apoptose hemmen und die Angiogenese regulieren45,46. Darüber hinaus haben wir eine Überrepräsentationsanreicherungsanalyse für den Gensatz „TOMLINS_PROSTATE_CANCER_UP“ aus der MSigDB-Datenbank am Broad Institute durchgeführt, in der die Gene aufgeführt sind, die bei Prostatakrebs im Vergleich zu gutartigem Gewebe hochreguliert sind47. Wie aus dem Heatmap-Diagramm hervorgeht, exprimierten alle CTC-Cluster sowie Prostatakrebs-Zelllinien hohe Mengen dieser Gene, was mit ihrem Prostatatumor-Ursprung übereinstimmt. Wir haben auch eine ähnliche Analyse für den Gensatz „CHANDRAN_METASTASIS_TOP50_UP“ aus der MSigDB-Datenbank durchgeführt, der die Gene umfasst, die in metastasierten Prostatakrebstumoren im Vergleich zum Primärgewebe hochreguliert sind48. Die Hochregulierung der mit Metastasierung verbundenen Gene in allen Clustern steht im Einklang mit dem erhöhten Metastasierungspotenzial von CTC-Clustern9,10. In der Gruppe beobachteten wir die höchsten Expressionsniveaus in den Genen HSPD1 und HSP90AA1, die Mitglieder von Hitzeschockproteinen (HSPs) sind und eine wichtige Rolle bei der Krebsentstehung und -invasion, dem Fortschreiten, der Metastasierung und der Arzneimittelresistenz bei verschiedenen Krebsarten spielen49,50. Außerdem exprimierten alle CTC-Cluster hohe G3BP1-Spiegel, die mit dem Malignitätsgrad des Tumors korrelierten51 und bei kastrationsresistentem Prostatakrebs (CRPC) am häufigsten vorkamen52, was mit der klinischen Diagnose von Patient-1 und Patient-1 übereinstimmt Patient-2 (Ergänzungstabelle 2).

In dieser Studie stellen wir eine Zellisolationstechnologie vor, die CTC-Cluster in unverarbeiteten Blutproben von Krebspatienten selektiv erkennt. Durch die direkte Erfassung von CTC-Clustern in speziell auf eine Polymermembran geätzten Mikrowells bieten die Cluster-Wells Vorteile gegenüber anderen Methoden zum Auffinden dieser Metastasenvorläufer in Blutproben. Erstens ermöglicht die enorme Anzahl von Mikrowells, die Blutbestandteile parallel untersuchen, die Analyse klinischer Proben in wenigen Minuten und gewährleistet gleichzeitig die Integrität der CTC-Cluster, indem sie ausschließlich Strömungsgeschwindigkeiten ausgesetzt werden, die unter denen im physiologischen Kreislauf liegen. Zweitens ermöglicht das planare Geräteformat die Formung von Mikrowell-Fallen direkt in der Kontaktebene mit CTC-Clustern, wodurch Zufälligkeiten in der Cluster-Fallen-Wechselwirkung beseitigt werden und sogar Dubletts mit hoher Empfindlichkeit erfasst werden können. Drittens schützt die Isolierung von CTC-Clustern in Mikrowells statt mit einem herkömmlichen Membranfilter sie vor äußeren Belastungen während oder nach der Verarbeitung, wodurch sie für nachgelagerte Tests zugänglich bleiben und die Notwendigkeit, Zellen auf einer Schale auszuplattieren, entfällt. Schließlich erfordert der entwickelte CTC-Cluster-Assay nur einen handelsüblichen Filterhalter und außer einer Pumpe keine zusätzliche Spezialhardware, wodurch er problemlos in Grundlagenforschung oder klinische Arbeitsabläufe integrierbar ist.

Mithilfe der Cluster-Wells an klinischen Blutproben fanden wir CTC-Cluster sowohl bei Prostata- als auch bei Eierstockkrebspatientinnen. Bemerkenswert ist, dass CTC-Cluster im peripheren Blut der meisten Patientinnen mit Eierstockkrebs in relativ hohen Konzentrationen gefunden wurden. Dieser Befund ist wichtig, da angenommen wird, dass die Ausbreitung des Eierstockkrebses auf umliegende Organe in der Bauchhöhle hauptsächlich durch Zellaggregate im Aszites vermittelt wird, deren Vorhandensein mit einer chemoresistenten rezidivierenden Erkrankung und einer schlechten Prognose verbunden ist53,54. Während sich herausstellte, dass CTC-Cluster aus kleineren Zellen als Tumorsphäroide in Aszites bestehen, waren sie in den getesteten Proben bis zu >150 Zellen groß, zwei Beobachtungen, die scheinbar im Widerspruch zueinander standen und potenzielle Auswirkungen auf die Zirkulation von CTC-Clustern haben der Körper. Die Häufigkeit von CTC-Clustern im peripheren Blut von Patientinnen mit Eierstockkrebs könnte wertvolle Möglichkeiten für weitere Studien bieten, um die hämatogene Verbreitung von Eierstockkrebs besser zu verstehen55 sowie Möglichkeiten zur Früherkennung von Krankheitsausbruch und Tumorrezidiven – zwei Hauptproblembereiche für Eierstockkrebs. da die Krankheit zu Beginn ihres Fortschreitens/Rezidivs asymptomatisch ist56.

Die RNA-Sequenzierung einzelner aus Mikrowells gesammelter CTC-Cluster ermöglichte die Untersuchung nicht nur der Tumorheterogenität zwischen Patienten, sondern auch der Intrapatienten-Heterogenität von CTC-Clustern und enthüllte Merkmale, die normalerweise in der Analyse auf Gewebeebene verborgen bleiben. Es wurde festgestellt, dass alle isolierten Prostatakrebs-Cluster Epithelmarker in unterschiedlichem Ausmaß stark exprimierten, während sie eine geringe Expression mesenchymaler Marker aufwiesen. Es wurde festgestellt, dass jede Patientengruppe konsistent die meisten Gene exprimierte, von denen berichtet wurde, dass sie bei Prostatakrebs hochreguliert sind, was mit ihrer Identität als Ursprung des Prostatatumors übereinstimmt. Darüber hinaus stimmten die Hochregulierung stammzellassoziierter Marker und die hohen Expressionsniveaus von Genen, die mit der Invasivität der Prostatatumorzellen in allen isolierten CTC-Clustern verbunden sind, mit den vorherigen Berichten über den deutlich verbesserten Metastasierungserfolg dieser Zellaggregate überein. Neben diesen gemeinsamen Merkmalen ergab die vergleichende Analyse der Transkriptome einzelner CTC-Cluster auch unterschiedliche patientenspezifische Profile. Die aus dem ersten Patienten isolierten Cluster exprimierten AR, KLK3 (PSA) oder FOLH1 (PSMA) und zeigten ein ähnliches Profil wie androgenresponsive LNCaP-Zellen, die als eine der Positivkontrollen für Prostatakrebszellen sequenziert wurden. Im Gegensatz dazu wurde in allen aus dem zweiten Patienten isolierten Clustern festgestellt, dass diese prostataspezifischen Gene herunterreguliert waren, ebenso wie in androgenunabhängigen PC-3-Zellen, die als andere positive Kontrollzellart für Prostatakrebs in unsere Studie einbezogen wurden .

Die Cluster-Wells ermöglichen ein schnelles Screening und eine hochempfindliche Isolierung intakter CTC-Cluster aus unverarbeiteten Vollblutproben ohne Abhängigkeit von tumorspezifischen Markierungen und maximieren so die effiziente Isolierung heterogener Krebszellen. Mithilfe von Chargen präzise konstruierter Clusterfallen, die auf einem Polymermembranfilter installiert sind, fängt der Cluster-Wells selbst die fragilsten CTC-Cluster ein und bewahrt sie für weitere Untersuchungen auf. Da die Cluster-Wells ohne Probenvorbereitung, komplizierte technische Schulung oder spezielle Instrumente außer einer Pumpe problemlos in klinische oder Forschungsabläufe integriert werden können, handelt es sich um ein Werkzeug, das dazu beitragen kann, Untersuchungen zur Rolle von CTC-Clustern bei der Krebsmetastasierung zu demokratisieren belegen auch ihren klinischen Nutzen als prognostische Marker für die Behandlung der Krankheit.

Am Georgia Institute of Technology wurden Blutproben von einwilligenden gesunden Spendern entnommen. An der Studie nahmen sieben gesunde Teilnehmer teil (fünf Männer, zwei Frauen im Alter von 24 bis 37 Jahren). Die Blutproben von Patienten mit Prostatakrebs wurden im Emory University Hospital und im Grady Memorial Hospital gesammelt, und die Blut- und Aszitesproben von Patienten mit Eierstockkrebs wurden im Northside Hospital gesammelt. Die Studie umfasste 10 Patienten mit Prostatakrebs (männlich, Altersspanne 59–71) und 10 Patienten mit Eierstockkrebs (weiblich, Altersspanne 27–78). Alle Sammlungen wurden gemäß Protokollen durchgeführt, die von den Institutional Review Boards des Northside Hospital, der Emory University und des Georgia Institute of Technology genehmigt wurden. Die Teilnehmer erhielten für ihre Anmeldung keine Vergütung.

Die Masterform, dh das Negativmuster der Cluster-Wells, wurde aus einem 500 μm dicken (100) Siliziumwafer mit einem Durchmesser von 4 Zoll unter Verwendung eines Drei-Masken-Prozesses hergestellt (ergänzende Abbildung 2). Als erste Maske wurde der Fotolack SC1813 (Shipley, Marlborough, MA) verwendet. Nach dem Aufschleudern und Strukturieren des Fotolacks wurde der Si-Wafer mithilfe von Deep Reactive Ion Etching (DRIE) bis zu einer Tiefe von 8 μm geätzt, um die quadratischen Säulen zu bilden. Anschließend wurde in einem LPCVD-Ofen eine dünne Schicht (300 nm) aus spannungsarmem Nitrid abgeschieden. Um das abgeschiedene Nitrid zu strukturieren, wurde der Wafer mit positivem Fotolack SPR 220-7.0 (Shipley, Marlborough, MA) beschichtet und mit einem maskenlosen Aligner (Heidelberg MLA150) belichtet. Die Nitridschicht unter dem freigelegten Bereich wurde mittels reaktivem Ionenätzen geätzt, um eine Hartmaske für den Nassätzprozess zu bilden. Das Silizium wurde in einer 45 %igen KOH-Lösung 15 Minuten lang bei 80 °C anisotrop geätzt, um die schrägen Wände zu bilden. Um schließlich das Negativmuster der Mikromulden zu bilden, wurde SPR 220-7.0-Fotolack als Maske verwendet, um mithilfe von DRIE 50 μm tiefe quadratische Gräben in den Wafer zu ätzen. Nach der Piranha-Reinigung (3:1-Mischung aus konzentrierter Schwefelsäure (H2SO4) und Wasserstoffperoxid (H2O2)) bei 120 °C für 10 Minuten wurde der mikrobearbeitete Siliziumwafer zuvor 8 Stunden lang unter Vakuumbedingungen mit Trichlor(octyl)silan beschichtet zum PDMS-Guss.

Nach der Mikrobearbeitung einer Silizium-Masterform (siehe Methoden: Formen der Cluster-Wells aus der Silizium-Masterform, ergänzende Abbildung 2) wurden in einer Laborumgebung die Formvorbereitung aus Polydimethylsiloxan (PDMS) und die Strukturierung von Polymervorrichtungen durchgeführt. Zunächst wurden PDMS-Präpolymer und sein Vernetzer (Sylgard 184, Dow Corning, Auburn, MI) im Verhältnis 10:1 gemischt und auf die Silikon-Masterform gegossen. Nach einer einstündigen Entgasung in einem Exsikkator wurde PDMS 4 Stunden lang in einem Ofen bei 65 ° C ausgehärtet, dann geschnitten und von der Silikon-Masterform abgezogen (ergänzende Abbildung 3a, i). Die Oberfläche der PDMS-Schicht wurde mit Sauerstoffplasma aktiviert und 8 Stunden lang mit Trichlor(octyl)silan beschichtet. Eine zuvor hergestellte und mit Silan beschichtete PDMS-Schicht wurde als Form für die Herstellung der sekundären PDMS-Form mit dem Negativmuster des Geräts verwendet (ergänzende Abbildung 3a, ii). Nach dem Abziehen (ergänzende Abbildungen 3a, iii) wurde eine sekundäre PDMS-Form zum Strukturieren des photohärtbaren Polymers auf Perfluorpolyether (PFPE)-Basis (Fluorolink MD700, Solvay) verwendet, das als Gerätematerial verwendet wird. Nach dem PDMS-zu-PDMS-Formungsprozess wurde die sekundäre PDMS-Form (ergänzende Abbildung 3b, i) auf eine Polyethylenterephthalat (PET)-Folie gelegt und mit Fluorolink MD700, gemischt mit 4 % w/w 2-Hydroxy-2-, gefüllt. Methylpropiophenon (Darocur 1173) unter 50 mbar Vakuum. Sobald die Form gefüllt ist, wird das Polymer mit UV-Licht ausgehärtet (Abb. 3a, iv), die sekundäre PDMS-Form wurde von der PET-Folie/Gerätestapel abgezogen (ergänzende Abb. 3a, v) und das Gerät (ergänzende Abb . 3b, ii-iv) wurde auf einem thermoelektrischen Kühler bei 4 ° C von der darunter liegenden PET-Folie gelöst, was eine leichtere Freisetzung des Polymergeräts ohne Beschädigung ermöglicht (ergänzende Abbildung 3a, vi).

Für die Charakterisierung der Cluster-Wells verwendeten wir analytische Versionen der Geräte mit kleinerer effektiver Filterfläche. Während aufgrund der Begrenzung der Aufnahmebildrate der Kamera ein Flussratenbereich von 1 bis 1,5 ml/h verwendet wurde, wurden die Flussgeschwindigkeiten bei Mikronetzen durch Variation der Größe der Geräte angepasst, wobei eine Verringerung der Größe einer Erhöhung der Flussrate entsprach. In diesen Charakterisierungsstudien wurde auch das Volumen der Blutprobe innerhalb praktischer Grenzen angepasst, um sicherzustellen, dass die Anzahl der von jeder Mikrovertiefung verarbeiteten Blutzellen der des tatsächlichen Geräts (mit 47 mm Durchmesser) bei der Verarbeitung von 10 ml Vollblut ähnlich war für jede getestete Bedingung. Folglich verwendeten wir ~750, ~375 und ~200 μl Vollblut, um die Geräteleistung bei Flussraten von 25, 100 bzw. >250 ml/h zu testen. Geräte mit kleinerem Durchmesser wurden an einem handelsüblichen Filterhalter mit 13 mm Durchmesser (GE Healthcare Life Sciences) mit größenangepassten hohlen PDMS-Schichten montiert, die den Flüssigkeitsfluss auf den interessierenden Bereich mit einem bestimmten Durchmesser begrenzen und die Bildung stagnierender Flussbereiche im Inneren verhindern Filterhalter. Vor dem Einbringen der Probe wurde der Versuchsaufbau (Abb. 2b) mit reinem Ethanol grundiert, gefolgt von einer PBS-Wäsche. Anschließend wurde der Aufbau 1 Stunde lang mit 3 % Rinderserumalbumin (BSA) inkubiert, um unspezifische Zelladhäsion zu minimieren. Die mit Hoechst-Farbstoff gefärbten Zellen (siehe separater Abschnitt über Zellkultur und -vorbereitung) wurden in Vollblut gegeben und mit einer Spritzenpumpe (Harvard Apparatus Infuse/Withdraw PHD Ultra) im Entnahmemodus durch den Versuchsaufbau laufen gelassen. Das Blut mit den versetzten Zellclustern durchquerte den Eingangskanal (50 μm hoch, 500 μm breit) der 2-Kanal-Mikrofluidschnittstelle, die Geräte-/Filterhalterbaugruppe und schließlich den Ausgangskanal (50 μm hoch, 500 μm breit). der mikrofluidischen Schnittstelle. Die mikrofluidischen Eingangs- und Ausgangskanäle wurden gleichzeitig mit 50 Bildern pro Sekunde im Fluoreszenzkanal (DAPI) per Video aufgezeichnet, wobei ein invertiertes Fluoreszenzmikroskop (Eclipse Ti, Nikon, Melville, NY) verwendet wurde, um die Zellen zu verfolgen, die in die analytische Version des Clusters eintreten und diese verlassen. Wells bzw. Anschließend wurde das aufgezeichnete Video von einer speziell entwickelten Software (Visual Studio, 2017) verarbeitet und die Anzahl der Cluster, die das Gerät betreten und verlassen, im Verhältnis zur Anzahl der Zellen innerhalb jedes Clusters ermittelt, die für die Berechnung des verwendet wird Erfassungseffizienz.

Um die Zuverlässigkeit des Bildgebungssystems zu testen, haben wir die 2-Kanal-Mikrofluidikschnittstelle in einer Schleife ohne angeschlossenes Gerät betrieben, wobei der Auslass des Eingangskanals über einen 8 cm langen Schlauch mit einem Innendurchmesser von 0,02 Zoll mit dem Einlass des Ausgangskanals verbunden war. Das Experiment wurde mit einer Spritzenpumpe durchgeführt, die auf 1,5 ml/h eingestellt war, und beide Mikrofluidikkanäle wurden mit 50 Bildern pro Sekunde unter Verwendung eines Fluoreszenzkanals (DAPI) per Video aufgezeichnet. Eine speziell geschriebene Software wurde verwendet, um die Bilder mit Zellereignissen in einem der Mikrofluidikkanäle zu extrahieren Kanäle. Nach der Analyse der Frames stellten wir fest, dass es praktisch keinen Verlust im System gab, als die Größenverteilung der Cluster, die die Eingangs- und Ausgangskanäle passierten, verglichen wurde (Ergänzungstabelle 1). Um die Gültigkeit der mit dem mikrofluidischen Aufbau erhaltenen Daten zu beurteilen haben wir Experimente zur Erfassungseffizienz bei 25 ml/h durchgeführt, indem wir die isolierten Cluster direkt auf dem Gerät gezählt haben. In diesen Experimenten wurde die mit Spikes versehene Population mithilfe eines Mikrofluidikkanals wie zuvor beschrieben abgebildet, um genaue Zählungen der mit Spikes versehenen Cluster zu erhalten. Die Cluster wurden in ein EDTA-Röhrchen mit 10 ml Vollblut injiziert und die aufgestockte Blutprobe anschließend mit 25 ml/h unter Verwendung von Cluster-Wells verarbeitet. Das Gerät wurde unter Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops abgebildet und die erfassten Clusterzahlen wurden mit der aufgestockten Population zur Messung der Einfangeffizienz verglichen (ergänzende Abbildung 4), die mit den mithilfe der mikrofluidischen Schnittstelle erhaltenen Einfangeffizienzdaten übereinstimmte.

Als biologische Modellproben verwendeten wir HeyA8 (erhalten von Dr. John F. McDonald, Georgia Institute of Technology), LNCaP (ATCC-CRL-1740; Manassas, VA), MDA-MB-231 (ATCC-HTB-26; Manassas). , VA) und MCF-7 (ATCC-HTB-22; Manassas, VA) Zelllinien. Die Zelllinien wurden in RPMI-1640- (LNCaP und HeyA8) oder DMEM-Medium (MDA-MB-231 und MCF-7) mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) (Seradigm, Radnor, PA) in einer 5 % CO2-Atmosphäre kultiviert 37 °C. Sobald sie eine Konfluenz von 80 % erreicht hatten, wurden die Zellen 2 Minuten lang mit 0,25 % Trypsin (Gibco) aus der Kulturflasche gelöst. Anschließend wurden die Zellen pelletiert, der Überstand entfernt und die Zellen durch vorsichtiges Pipettieren in 1 × PBS-Lösung resuspendiert. Bei allen in dieser Studie verwendeten Zelllinien wurde zunächst festgestellt, dass pelletierte Zellen in Gruppen von Hunderten bis Tausenden von Zellen aneinander haften und anschließend mechanisch durch Pipettieren in kleinere Cluster innerhalb des für unsere Studie interessierenden Größenbereichs dissoziiert werden.

Für die Experimente zur Einfangeffizienz wurde eine Kernfärbung zur visuellen Verfolgung von Clustern durchgeführt. Vor dem Ablösen der Zellen von der Kolbenoberfläche wurden die Zellkerne markiert, indem die Zellen 20 Minuten lang in einer 4-ml-Hoechst-33342-Farbstofflösung (Thermo Fisher – Kat.-Nr.: H3570) (1:1000) in einer 5 %igen CO2-Atmosphäre bei 37 °C inkubiert wurden C. Nach dem Abwaschen der Färbelösung wurden die Zellen abgelöst und in 1x PBS-Lösung resuspendiert. Zur Herstellung der Testproben mit einigen hundert (184–552 Clustern) Zellclustern pro Experiment wurden kleine Aliquots (<10 μl) der Suspension verwendet. Die Anzahl der mit Spikes versehenen Cluster in unseren Experimenten wurde so festgelegt, dass (1) die mit Spikes versehene Clusterpopulation groß genug war, um Cluster unterschiedlicher Größe für einen umfassenden Test zu enthalten, und (2) die Anzahl der Cluster das Gerät nicht mit der Mehrheit der Cluster übersättigte Brunnen bleiben leer.

Um die Lebensfähigkeit der Zellen zu bestimmen, wurde ein Lebend-/Tot-Assay (ab115347, Abcam, Cambridge, MA) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Der Assay wurde in 5-facher Konzentration (1:200) mit der 1-fach-PBS-Lösung gemischt, die die Kontrolle und die freigesetzten Zellen enthielt. Nach der 15-minütigen Inkubation in dunkler Umgebung wurden die Proben mit einem inversen Fluoreszenzmikroskop (Eclipse Ti, Nikon, Melville, NY) abgebildet, wobei die lebenden und toten Zellen in grünen (FITC) und roten (TexasRed) Kanälen beobachtet wurden. bzw. (Ergänzende Abbildung 9).

Die eingefangenen Cluster wurden zunächst in 2,5 % Glutaraldehyd und dann in 1 % Osmiumtetroxid fixiert, beide verdünnt in 0,1 M Natriumkacodylat. Nach der Fixierung wurden die Zellen in 50 %, 70 %, 80 und 95 % Ethanollösungen in Wasser und 100 % Ethanol nacheinander jeweils 15 Minuten lang dehydriert. Die Probe wurde mit Hexamethyldisilazan (HMDS) (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA) gewaschen und über Nacht bei Raumtemperatur getrocknet. Das Gerät und die eingefangenen Cluster wurden mit einem Sputtersystem mit Pt/Pd beschichtet und mit einem Hitachi SU8230 Rasterelektronenmikroskop abgebildet.

Blutproben von einwilligenden gesunden Spendern wurden am Georgia Institute of Technology nach einem vom IRB genehmigten Protokoll entnommen. Die Blutproben von Patienten mit Prostatakrebs wurden im Emory University Hospital und im Grady Memorial Hospital entnommen, und die Blut- und Aszitesproben von Patienten mit Eierstockkrebs wurden im Northside Hospital nach vom IRB genehmigten Protokollen entnommen. Die Blutproben wurden in EDTA-Röhrchen (BD Vacutainer) gesammelt und innerhalb von 4 Stunden nach der Blutentnahme verarbeitet. Um eine Sedimentation zu verhindern, wurden die Röhrchen bis zur Verwendung auf eine Wippe gestellt. Aszitesproben von Patientinnen mit Eierstockkrebs wurden in evakuierten Glasbehältern an das Georgia Institute of Technology überführt und innerhalb von 4 Stunden nach der Entnahme verarbeitet.

Die Geräte wurden in die Filterhalter eingesetzt und mit reinem Ethanol benetzt. Nach der Benetzung wurde Ethanol mit 1× PBS weggewaschen. Vor der Verwendung wurde die Einheit aus Gerät und Filterhalter 1 Stunde lang mit 3 % BSA inkubiert, um unspezifische Zelladhäsion auf den Oberflächen zu minimieren. Anschließend wurde das BSA mit 1× PBS abgewaschen, bevor Blut- oder Aszitesproben eingebracht wurden. Sowohl Aszites- als auch unverarbeitete Vollblutproben wurden mit einer Spritzenpumpe (Harvard Apparatus Infuse/Withdraw PHD Ultra) im Entnahmemodus mit einer Durchflussrate von 25 ml/h durch die Geräte geleitet. Anschließend wurden die Geräte vor der Immunfluoreszenzfärbung 1 Stunde lang mit 1 × PBS-Lösung gewaschen (siehe separaten Abschnitt zur Immunfluoreszenzfärbung von CTC-Clustern).

Nach der Verarbeitung der Proben wurden die eingefangenen Zellen 10 Minuten lang mit 4 % Paraformaldehyd (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA) fixiert und anschließend mit 1 % Triton-X (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) in PBS permeabilisiert 10 Minuten. Vor der Immunfluoreszenzfärbung wurde die Vorrichtung/Filterhalter-Baugruppe 30 Minuten lang mit einem Blockierungspuffer, der 2 % Ziegenserum und 3 % BSA enthielt, inkubiert. Für Prostataproben: Cytokeratin 8/18 (Invitrogen – Kat.-Nr.: MA5-32118, Klon: SU0338, (1:400)), Vimentin (Invitrogen – Kat.-Nr.: MA5-14564, Klon: SP20, (1:1000)) , PSA/KLK3 (Cell Signaling Technology – Kat.-Nr.: 5365S, Klon: D6B1, (1:750)), EpCAM (Invitrogen – Kat.-Nr.: MA5-29246, Klon: 28, (1:400)) und Anti-CD45 (BD Biosciences – Kat.-Nr.: 555480, Klon: HI30, (1:500)) und für Eierstockproben Cytokeratin 7 (Invitrogen – Kat.-Nr.: MA5-32173, Klon: ST50-05, (1:400)), Cytokeratin 8/18 (Invitrogen – Kat.-Nr.: MA5-32118, Klon: SU0338, (1:400)), Vimentin (Invitrogen – Kat.-Nr.: MA5-14564, Klon: SP20, (1:1000)) und Anti-CD45 (BD Biosciences – Kat.-Nr.: 555480, Klon: HI30, (1:500)) Der primäre Antikörpercocktail wurde eingeführt und über Nacht inkubiert. Die überschüssigen Antikörper wurden mit 1× PBS abgewaschen. Anschließend wurden die passenden Sekundärantikörper Alexa Fluor 488 (Invitrogen – Kat.-Nr.: A-11008, (1:500)) und Alexa Fluor 594 (Invitrogen – Kat.-Nr.: A21125, (1:500)) durch das Gerät laufen lassen und inkubiert 1 Stunde lang gewaschen und mit 1× PBS abgewaschen. Die Zellkerne wurden 10 Minuten lang mit 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) (Invitrogen – Kat.-Nr.: D1306, (1:1000)) gefärbt und die Geräte wurden mit 1× PBS gewaschen. Zuletzt wurden die Geräte aus den Filterhaltern entfernt und zur Bildgebung zwischen zwei Glasobjektträgern montiert.

Die eingefangenen, lebenden CTC-Cluster wurden mit Alexa 488-konjugierten Antikörpern gegen EpCAM (Cell Signaling Technology – Kat.-Nr.: 5198S, (1:400)), Prostata-spezifisches Membranantigen (PSMA) (Biolegend – Kat.-Nr.: 342506, Klon) gefärbt : LNI-17, (1:80)) und die kontaminierenden WBCs wurden mit PE-CD45 (TRITC) (BioLegend – Kat.-Nr.: 368510, Klon: 2D1, (1:40)) gefärbt. Das Gerät mit den eingefangenen Clustern wurde in einer Petrischale montiert und dann mit einem inversen Fluoreszenzmikroskop (Eclipse Ti, Nikon, Melville, NY) abgebildet. Identifizierte Cluster wurden direkt vom Gerät aus mikromanipuliert und mit dem Mikromanipulator Eppendorf TransferMan 4r in die PCR-Röhrchen mit RLT- (Qiagen) + BME-Puffer (Sigma-Aldrich) übertragen. Während der Mikromanipulation wurde die Schale mit 1× PBS ergänzt, um das Austrocknen der Mikrovertiefungen zu verhindern, was bei Raumtemperatur etwa 10 Minuten dauerte. Die Röhrchen wurden 1 Minute lang gevortext und in einen Gefrierschrank mit –80 °C überführt. Es wurde beobachtet, dass die meisten kontaminierenden Leukozyten während der Clusterentnahme am Gerät haften blieben. Dennoch wurden aus Cluster-Wells mikromanipulierte CTC-Cluster in eine leere Petrischale entladen und dann erneut entnommen, um mögliche Artefakte durch WBC-Kontamination bei der RNA-Sequenzierung zu verhindern.

Die Blutprobe wurde mit den Cluster-Wells bei einer Flussrate von 25 ml/h verarbeitet. Die Kerne der eingefangenen Zellen wurden mit Hoechst-Farbstoff (Thermo Fisher – Kat.-Nr.: H3570, (1:1000)) gefärbt, und die Membranen der kontaminierenden WBCs wurden mit PE-CD45 (TRITC) (BioLegend – Kat.-Nr.: 368510) gefärbt , (1:40)) zur negativen Identifizierung potenzieller CTC-Cluster auf dem Gerät. Angereicherte CTC-Cluster wurden zuerst auf dem Gerät als Basislinie abgebildet (ergänzende Abbildung 11, i) und CTC-Cluster auf dem Gerät wurden anschließend einem auf Membranintegrität basierenden Lebensfähigkeitstest, NucRed Dead 647 Ready Probes (Thermo Fisher – Kat.-Nr.: R37113), unterzogen ), gemäß vom Hersteller bereitgestelltem Protokoll. Fluoreszenzbilder der untersuchten CTC-Cluster wurden aufgenommen, um die Fluoreszenz des Lebensfähigkeitsreporterfarbstoffs (Cy-5) aufzuzeichnen (ergänzende Abbildung 11, ii). Um ihren Tumorursprung nachzuweisen, wurden die Zellen dann mit 4 % PFA fixiert, das Gerät in einen Filterhalter gelegt und ein fixiertes Färbeprotokoll unter Verwendung von Antikörpern gegen Cytokeratin 7, 8/18, Vimentin (FITC) und CD45 (Texas Red) angewendet. und Cluster wurden mit einem Fluoreszenzmikroskop abgebildet (Ergänzende Abbildung 11, iii). Der Lebensfähigkeitstest wurde dann validiert, indem die fixierten CTC-Cluster als Negativkontrolle untersucht wurden und die CTC-Cluster noch einmal mit einem Fluoreszenzmikroskop abgebildet wurden, um ein negatives Lebensfähigkeitsergebnis aufgrund einer beeinträchtigten Membran der fixierten Zellen zu bestätigen (ergänzende Abbildung 11, iv). .

RNA wurde aus den lysierten Proben mit dem Macherey-Nagel Nucleospin RNA XS Kit extrahiert. Doppelsträngige cDNA wurde mit dem Takara Bio SMART-Seq v4 Ultra-Low-Input-RNA-Kit zur Sequenzierung generiert. Anschließend wurden mit Barcode versehene, mit Illumina kompatible Sequenzierungsbibliotheken mithilfe des Illumina Nextera XT DNA-Bibliotheksvorbereitungskits mit einer verkürzten Tagmentierungszeit von 3 Minuten erstellt und die Proben wurden unter Verwendung eines Perlenverhältnisses von 1:1 gereinigt, um das Vorhandensein von Primerdimeren zu eliminieren. Die Qualität der Bibliotheken wurde auf dem Agilent Bioanalyzer mithilfe eines hochempfindlichen DNA-Chips bestimmt und die Konzentrationen wurden mithilfe des Invitrogen Qubit-Fluorometers bestimmt. Die mit dem Barcode versehenen Proben wurden dann gepoolt und auf dem Illumina NextSeq 500 und NovaSeq 6000 sequenziert.

Rohe Fastq-Dateien wurden mit FASTQC auf Qualität analysiert und mit TrimGalore (Ref: https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore) zugeschnitten, um Adaptersequenzen und Lesevorgänge mit geringer Qualität zu entfernen (Mindest-Phred-Score >24). Zugeschnittene Lesevorgänge wurden mit dem STAR-Mapper (PMID: 23104886) auf den hg38-Build des menschlichen Genoms abgebildet und Transkripte wurden durch Zuordnung zur GenCODE.v24-Annotationsversion des menschlichen Transkriptoms quantifiziert. Für diese Prostata-CTC-Cluster wurden im Median 83,15 Mio. Lesevorgänge in den STAR-Mapper eingegeben (Bereich 53,7–129,79 Mio.) und im Median 88,8 % der Lesevorgänge ausschließlich dem menschlichen Transkriptom zugeordnet (Bereich 80,57–91,59 %). Insgesamt wurden 16.412 Transkripte mit mindestens 10 zugeordneten Lesevorgängen in einer Probe erkannt und für die DESeq2-Analyse in R (PMID: 25516281) verwendet. Insgesamt 12.149 kartierte Ensembl-Gene, geordnet nach DESeq2 log2foldchange, wurden als Eingabe für die GSEA-Analyse (PMID: 17644558) unter Verwendung des WebGestalt-Tools (PMID: 28472511) verwendet. Angereicherte Gensätze wurden mithilfe der Cancer Hallmark 50-Gensätze und der KEGG Pathway-Gensätze analysiert. Die t-SNE-Analyse wurde in R unter Verwendung des M3C-Pakets mit Seed = 123 und Perplexity = 1 durchgeführt. Die Gesamtlesezahlen wurden mithilfe von Manschettenknöpfen (PMID: 22383036) auf FPKM-Werte normalisiert. Insgesamt 26.391 Transkripte hatten einen FPKM > 1 in mindestens einer Probe und 10.885 Transkripte hatten einen mittleren FPKM > 1. Zur Verwendung im Heatmap-Plot wurde die Anzahl der Reads pro Million (RPM) für die Gene generiert. Abschließend wurde der Heatmap-Plot mit dem Online-Tool ClustVis erstellt.

Charakterisierungsexperimente wurden als drei unabhängige Experimente durchgeführt. Sofern nicht anders angegeben, werden die Daten als Mittelwert ± SD dargestellt. Zur Bestimmung der Stichprobengröße wurde keine statistische Methode verwendet. Die Experimente waren nicht randomisiert. Die hergestellten Geräte wurden zufällig für die Charakterisierungsexperimente und die Verarbeitung von Patientenproben ausgewählt. Patientenproben wurden basierend auf ihrem Tumorursprung (Prostata vs. Eierstock) in verschiedene Gruppen eingeteilt. Für die Verarbeitung der Patientenblutproben wurde eine Verblindung eingesetzt, wobei alle Patienteninformationen außer der Krebsart bis zum Ende der Studie zurückgehalten wurden. Die RNA-Sequenzierungsdaten wurden vor der Auswertung durch die Autoren von unvoreingenommenen Bioinformatik-Pipelines verarbeitet. Die in den Abb. gezeigten repräsentativen Experimente. 1b, 2a, 3e und ergänzende Abbildungen. 3b, 9, 10 wurden zur Veranschaulichung einmal durchgeführt. Ebenso, Abb. 4a–c, 5a, b und ergänzende Abbildungen. 10, 11a, b entsprechen spezifischen Patientenproben und die Experimente wurden einmal zum Zeitpunkt der Verarbeitung dieser Proben durchgeführt.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Die Autoren erklären, dass die Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, in der Arbeit und der ergänzenden Informationsdatei verfügbar sind. Die in dieser Studie generierten rohen und verarbeiteten Sequenzierungsdaten wurden in der Gene Expression Omnibus-Datenbank (GEO) des NCBI unter dem Zugangscode GSE202650 hinterlegt. In dieser Studie verwendete öffentlich verfügbare Datensätze sind Hallmark50-Gensätze [https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/genesets.jsp?collection=H] und hg38-Build des menschlichen Genoms [https://www. ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCF_000001405.40], KEGG-Pathway-Datenbank [https://www.genome.jp/kegg/pathway.html], Gensatz „CHANDRAN_METASTASIS_TOP50_UP“ [https://www.gsea- msigdb.org/gsea/msigdb/cards/CHANDRAN_METASTASIS_TOP50_UP], Gensatz „TOMLINS_PROSTATE_CANCER_UP“ [https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/cards/TOMLINS_PROSTATE_CANCER_UP]. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

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Referenzen herunterladen

Die Autoren danken allen Patienten und gesunden Blutspendern, die an dieser Studie teilgenommen haben. Die Autoren danken außerdem Dr. Anton V. Bryksin und Naima Djeddar von Georgia Tech Molecular Evolution Core, Sakeenah Hicks, Dr. Christopher Scharer und Dr. Lyra M. Griffiths von Emory Integrated Genomics Core (EIGC) und Dr. Henry R. Johnston und Dr. Robert A. Arthur von Emory Integrated Computational Core (EICC) für ihre Beiträge zur RNA-Sequenzierung und Datenanalyse; und den Mitarbeitern des Georgia Tech Stamps Health Center für ihre Hilfe bei der Blutentnahme von gesunden Spendern. Diese Arbeit wurde durch die Startgelder unterstützt, die AFS vom Georgia Institute of Technology zur Verfügung gestellt wurden. Die Forschung wurde teilweise auch vom Büro des stellvertretenden Verteidigungsministers für Gesundheitsangelegenheiten im Rahmen des Prostate Cancer Research Program unter der Auszeichnungsnummer W81XWH-20-1-0649 (AFS), des Georgia Tech Petit Institute Seed Grant (AFS und JFM) unterstützt ), den Dunwoody Golf Club Prostate Cancer Research Award und den Winship Invest$ Pilot Grant vom Winship Cancer Institute der Emory University (AFS und MAB).

Fakultät für Elektrotechnik und Informationstechnik, Georgia Institute of Technology, Atlanta, GA, USA

Mert Boya, Tevhide Ozkaya-Ahmadov, Brandi E. Swain, Chia-Heng Chu, Norh Asmare, Ozgun Civelekoglu, Ruxiu Liu, Dohwan Lee und A. Fatih Sarioglu

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Sherry Tobia

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Shweta Biliya, L. DeEtte McDonald, John F. McDonald und A. Fatih Sarioglu

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Bassel Nazha, Omer Kucuk, Carlos S. Moreno, Mehmet A. Bilen und A. Fatih Sarioglu

Abteilung für Hämatologie und Medizinische Onkologie, Emory University School of Medicine, Atlanta, GA, USA

Bassel Nazha, Omer Kucuk und Mehmet A. Bilen

Abteilung für Urologie, Emory University School of Medicine, Atlanta, GA, USA

Martin G. Sanda

Integriertes Krebsforschungszentrum, Georgia Institute of Technology, Atlanta, GA, USA

Benedict B. Benigno, John F. McDonald und A. Fatih Sarioglu

Ovarian Cancer Institute, Atlanta, GA, USA

Benedict B. Benigno und John F. McDonald

Abteilung für Pathologie und Labormedizin, Emory University School of Medicine, Atlanta, GA, USA

Carlos S. Moreno

Institut für Elektronik und Nanotechnologie, Georgia Institute of Technology, Atlanta, GA, USA

A. Fatih Sarioglu

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MB und AFS haben die Forschung entworfen und das Manuskript geschrieben. MB und RL stellten die Geräte her. MB führte die Experimente durch. MB und NA entwickelten die Analysesoftware. MB und AFS analysierten die Daten. ST, LDM, BN, OK, MGS, BBB, MAB und JFM halfen bei der Beschaffung von Patientenproben. MB, TOA, BES und CHC verarbeiteten und analysierten die Patientenproben. SB half bei der Bibliotheksvorbereitung und der RNA-Sequenzierung. CSM verarbeitete und analysierte die Sequenzierungsdaten. TOA, NA, OC und DL trugen zur Manuskripterstellung bei. Alle Autoren haben das endgültige Manuskript gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit A. Fatih Sarioglu.

MB und AFS sind Erfinder eines vom Georgia Institute of Technology angemeldeten Patents (US-Patentanmeldung Nr. 17/619.276). Die Patentanmeldung umfasst die entwickelte CTC-Cluster-Isolationstechnologie. Die übrigen Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Nature Communications dankt Sunitha Nagrath und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Boya, M., Ozkaya-Ahmadov, T., Swain, BE et al. Markierungsfreie Hochdurchsatz-Isolierung zirkulierender Tumorzellcluster in vernetzten Mikrovertiefungen. Nat Commun 13, 3385 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-31009-9

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Eingegangen: 23. November 2020

Angenommen: 26. Mai 2022

Veröffentlicht: 13. Juni 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-31009-9

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