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Jan 09, 2024

Übergang zum Schnitt-CUBE-Workflow für die Generierung und Abbildung von Organoiden mit lokalisierter Differenzierung

Band Kommunikationsbiologie

Communications Biology Band 6, Artikelnummer: 299 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Fortschritte in der Organoidkultur haben zu verschiedenen In-vitro-Miniorganen geführt, die in vielerlei Hinsicht natives Gewebe nachahmen. Dennoch bleibt der Engpass bestehen, komplexe Organoide mit Körperachsenmustern zu erzeugen und die Ausrichtung der Organoide während der Analyseprozesse nach dem Experiment beizubehalten. Hier stellen wir einen Arbeitsablauf für die Kultivierung von Organoiden mit Morphogengradienten unter Verwendung eines CUBE-Kulturgeräts vor, gefolgt vom Schneiden von Proben mit dem CUBE, um Informationen über die Gradientenrichtung zu erhalten. Wir zeigen, dass hiPSC-Sphäroide, die mit zwei getrennten Differenzierungsmedien an gegenüberliegenden Enden des CUBE kultiviert wurden, zu einer lokalisierten Expression der jeweiligen Differenzierungsmarker führten, im Gegensatz zur homogenen Verteilung der Marker in den Kontrollen. Wir beschreiben auch die Prozesse für Kryo- und Paraffinschnitte von Sphäroiden in CUBE, um Informationen zur Gradientenorientierung beizubehalten. Dieser Arbeitsablauf von der Gradientenkultur bis zum Schnitt mit CUBE kann Forschern ein praktisches Werkzeug bieten, um immer komplexere Organoide zu erzeugen und ihre Entwicklungsprozesse in vitro zu untersuchen.

Pluripotente Stammzellen (PSCs) und daraus abgeleitete Organoide bieten eine pragmatische Möglichkeit, die Bildung von Geweben und Organen während der frühen menschlichen Entwicklung zu modellieren und zu untersuchen, da echte Proben schwierige ethische Fragen aufwerfen1,2,3,4. Protokolle zur Erzeugung der verschiedenen Organoide, die natives Gewebe nachahmen, basieren im Allgemeinen auf der sequentiellen Manipulation der Aktivierung oder Hemmung von Signalwegen wie Nodal, Hedgehog, Notch, Wnt oder BMP zu unterschiedlichen Zeitpunkten, um eine Differenzierung zu bestimmten Abstammungslinien zu induzieren, wie z Bildung von Organoiden, Epiblasten8,9 und Gastruloiden10 aus dem Darm5, der Niere6 und der Lunge7.

Dennoch bleibt die Kontrolle des Wachstums und der Differenzierung von Zellen entlang einer Körperachse in 3D-Organoidkulturen eine Herausforderung. In vitro kann eine anterior-posteriore und dorsal-ventrale Strukturierung in Organoiden durch zelluläre Selbstorganisation entstehen11,12 oder durch die Verschmelzung separat differenzierter Organoide zu einem Assembloid erreicht werden, beispielsweise bei zerebralen Organoiden mit unterschiedlichen Gehirnregionen oder Gallenorganoiden mit Leber und Galle Trakt- und Pankreaskomponenten13,14. Die Einschränkung bei diesen Methoden besteht jedoch darin, dass die Kontrolle über die den Zellen zugeführten räumlichen Informationen recht gering ist, da die Zellen in einem einzigen einheitlichen Medium kultiviert werden. Alle Zellen innerhalb des Zellclusters, aus dem das Organoid besteht, erhalten die gleichen Differenzierungshinweise von den Signalmolekülen im Medium. In vivo hingegen tragen Konzentrationsgradienten von Morphogenen aus anderen Quellen auch dazu bei, zu bestimmen, wohin Zellen gehen und welchen Phänotyp oder welches Muster sie während der Entwicklung annehmen sollen15,16. Beispielsweise ist die Bildung des Neuralrohrs auf Signale der Chorda dorsalis und der nicht-neuralen Ektodermschicht angewiesen17, und die Nephrone der Niere entwickeln sich durch den Austausch verschiedener Signale zwischen der Ureterknospe und dem metanephrischen Mesenchym18. Daher besteht die Notwendigkeit, Morphogengradienten zu replizieren, um Organoide zu erzeugen, die den nativen Geweben in vivo ähnlicher sind.

Es wurden mehrere technische Technologien entwickelt, um die Zufuhr räumlicher Gradienten von Signalmolekülen zu Zellen in vitro nachzuahmen. PSCs, die für die Expression von Sonic Hedgehog (Shh)19 entwickelt wurden, oder mit Morphogenen getränkte Agarosekügelchen20 können in der Nähe des sich entwickelnden Organoids platziert werden, und die Diffusion von Molekülen von der Quelle zu den differenzierenden Zellen erzeugt einen hohen bis niedrigen Konzentrationsgradienten von Morphogenen. Darüber hinaus wurden auch verschiedene modifizierte Transwells und Mikrogeräte entwickelt, die die Kultivierung von Zellen mit zwei separaten Medienkompartimenten ermöglichen, um Morphogengradienten in entgegengesetzten Richtungen über die Zellen hinweg zu erzeugen21,22,23,24,25,26. Diese Technologien sind jedoch nicht ohne Nachteile: (1) Sie erfordern komplizierte Vorbereitungs- und Einrichtungsverfahren, die in den meisten biologischen Laboratorien ohne Fachkenntnisse und Ausrüstung nicht einfach durchzuführen sind, (2) es mangelt ihnen an Kontrolle über die Platzierung und Positionierung der Probe im Gerät, und (3) es ist schwierig, die Probe nach dem Experiment für weitere Analysen aus dem Gerät zu entnehmen, ohne die Probe stark zu beschädigen oder die Orientierung der Probe zu verlieren. Insbesondere die Fähigkeit, Informationen über die Ausrichtung des Gradienten, dem die Zellen ausgesetzt waren, beizubehalten, ist entscheidend, um eine ordnungsgemäße Analyse der Probe sicherzustellen.

Unser Ziel war es daher, diese Probleme anzugehen, indem wir eine einfache, benutzerfreundliche Gradientenkulturplattform entwickelten, um die Differenzierung von PSCs in Organoide mit unterschiedlichen lokalisierten Mustern zu steuern und gleichzeitig die Probenintegrität und Gradientenorientierung für bildgebende Analyseprozesse beizubehalten. Um dies zu erreichen, verwenden wir ein zuvor entwickeltes CUBE-Kulturgerät, um die Handhabung von in ECM-Hydrogel kultivierten Proben und die Wiederholbarkeit der Zellaussaat und Musterbildung zu verbessern27,28. Aufgrund der Einfachheit des CUBE-Geräts, das aus einem einfachen Hartmaterialrahmen mit durchsichtigen Wänden besteht, die die Sicht auf die darin enthaltene Probe ermöglichen, können Design und Zusammensetzung des CUBE leicht an die Anforderungen des Experiments angepasst werden. In dieser Studie wurde beispielsweise das Rahmendesign geändert, um eine wasserdichte Integration in ein Fluidgerät zu gewährleisten, und das Rahmenmaterial wurde so ausgewählt, dass es mit den organischen Reagenzien kompatibel ist, die bei der Probenverarbeitung nach dem Experiment verwendet werden. Hier zeigen wir zunächst, wie wir iPSC-Zellsphäroide präzise an der gewünschten Position im CUBE positionieren können. Anschließend demonstrieren wir, wie einfach ein Gradient im CUBE erzeugt werden kann, um eine lokalisierte Differenzierung von iPSCs zu induzieren, indem wir ihn einfach auf ein Gradientenchipgerät mit zwei Kompartimenten übertragen, ohne dass komplizierte Pumpensysteme eingerichtet werden müssen. Abschließend präsentieren wir die Kompatibilität der Gradientenplattform mit verschiedenen Verarbeitungsmethoden nach dem Experiment (Kryo- und Paraffinschnitte) für die Bildgebung und Analyse unter Beibehaltung der Informationen zur Gradientenorientierung (Abb. 1). Mit diesem Gradient-in-CUBE-Workflow können Organoide mit kontrollierter Körperachsendifferenzierung erreicht werden, wodurch immer komplexere In-vitro-Modelle bereitgestellt werden, in denen wir die Auswirkungen von Morphogengradienten bei der Steuerung der Zelldifferenzierung und -entwicklung in Gewebe, Organe, und schließlich Körpersysteme, um unser Verständnis der Entwicklungsprozesse beim Menschen zu verbessern.

Das Konzept für diese Arbeit bestand darin, das CUBE-Kulturgerät zu verwenden, um zunächst die Aussaatposition der Zellen am gewünschten Ort zu kontrollieren, b dann den CUBE auf einen Gradient-in-CUBE-Chip zu übertragen, um Zellen mit einem Morphogengradienten zu kultivieren, und c schließlich Schneiden Sie die Probe mit dem CUBE ab, um die Informationen zur Gradientenausrichtung in den Abschnitten beizubehalten.

Gradienten der Morphogen-Signalübertragung tragen zur Spezifizierung und Strukturierung des Zellschicksals in sich entwickelnden Geweben bei29, und die Rekapitulation dieses Phänomens in vitro könnte die Entwicklung immer komplexerer Organoidmodelle fördern. Bei Organoiden, die in einem einzigen einheitlichen Medium in einer Wellplatte kultiviert werden und bei der Strukturierung hauptsächlich auf Selbstorganisation angewiesen sind, ist eine Differenzierung anhand von Gradientenmerkmalen jedoch schwierig zu erreichen30. Obwohl es viele Berichte über Methoden zur Kultivierung von Organoiden mit Morphogengradienten gibt19,20,31, schränken der komplizierte Aufbau und die schlechte Fähigkeit zur Probenhandhabung sowie die Aufrechterhaltung der Gradientenorientierung während der Analyse ihre weit verbreitete Akzeptanz in der Organoidgemeinschaft ein. Indem wir uns die einfache Handhabung des CUBE-Geräts zunutze machten, haben wir einen Arbeitsablauf von der Kultivierung von Organoiden mit Morphogengradienten bis zur Abbildung von Proben mit Gradientenorientierung mit den folgenden Prozessen etabliert: (1) Kontrolle der anfänglichen Aussaatposition der Zellen im CUBE, die dies ermöglicht Zellen, um in jedem Experiment konsistente Gradienteninformationen zu erhalten, (2) einen Gradienten der Morphogensignalisierung entlang einer Achse der Zellprobe zu erzeugen und (3) die Probe mit dem CUBE zu schneiden, um Informationen über die Gradientenrichtung beizubehalten.

Die präzise Platzierung der Zellen im CUBE ist wichtig, um die Konsistenz der von den Zellen empfangenen Gradientensignale sicherzustellen. Beispielsweise unterscheiden sich die Gradienteninformationen, die von Zellen erfasst werden, die zu nahe an einem Ende des WÜRFELS platziert wurden, von denen, die von Zellen in der Mitte des WÜRFELS erfasst werden. Um die Aussaatposition der Zellen im CUBE zu steuern, wurde eine Formkappe mit einer Säulenstruktur verwendet, um an der gewünschten Position im Hydrogel im CUBE eine Aussaattasche zu schaffen, sowie Rillen, um die präzise Passform der Formkappe auf dem CUBE zu gewährleisten entworfen wurde (Abb. 2b(i)). Der Prozess zur Herstellung einer Saattasche und von Saatzellsphäroiden in der Tasche ist in Abb. 2b(ii) dargestellt und im Abschnitt „Methoden“ beschrieben. Durch die Verwendung dieser Aussaatmethode können Zellen immer mit geringen Abweichungen an der gewünschten Stelle ausgesät werden, im Vergleich zur manuellen Positionierung der Zellen ohne Führung, was zu einer ungenauen Aussaat mit hohen Abweichungen führt (ergänzende Abbildung 1). Obwohl man argumentieren könnte, dass eine gut ausgebildete Person oder ein Roboter in der Lage sein könnte, Zellen im ungehärteten Gel mit hoher Genauigkeit zu positionieren, ohne dass die Formkappe erforderlich ist, kann das Gelierungsverhalten weicher Hydrogele wie Kollagen oder Matrigel je nach Modell stark variieren Dies hängt von der Temperatur und der Handhabung der Probe ab und es ist schwierig vorherzusagen, wann das Gel ausreichend polymerisiert sein wird, um die Zellen in Position zu halten. Um zu verdeutlichen, wie einfach diese Methode von jedem genutzt werden kann, haben wir unsere Laborsekretärin und einen Mittelschüler, die beide keine Erfahrung mit der Verwendung des CUBE oder der Formkappe hatten, angeworben, um dasselbe Experiment durchzuführen. Mit minimalem Training gelang es beiden, mit einer Genauigkeit zu säen, die der eines erfahrenen Benutzers ähnelte, und mit einer deutlich höheren Genauigkeit im Vergleich zu einem erfahrenen Benutzer ohne Formkappe (ergänzende Abbildung 1).

ein CUBE-Herstellungsprozess (i) CUBE-Designs für Paraffin- und Kryo-Schnitte. (ii) Prozess zum Anbringen der PDMS-Seitenwände am CUBE-Gerät. b Zellaussaatprozess (i) Formkappendesign. (ii) Verfahren zur Aussaat von Zellen in der Aussaattasche, die durch die Formkappe im Hydrogel im CUBE entsteht. c Gradient-in-CUBE-Herstellungsprozess (i) Entwürfe für Formen zur Herstellung des Deckels und der Basis des Chips. (ii) Verfahren zur Herstellung von PDMS-Chips aus Formen und Anbringen des Deckels an der Basis durch NSD, eine doppelseitige PDMS-Klebedichtung. d Schnitte für die Bildgebung. (i) Verfahren zum Einbetten der Proben in Kryomedium und zum Schneiden mit CUBE. (ii) Verfahren zum Einbetten der Proben in Paraffin mit dem CUBE-Halter und anschließendes Schneiden mit einer markierten Kante, um die Ausrichtung der Probe beizubehalten.

Um einen Gradienten über die Länge des CUBE zu erzeugen, wurde ein Gradient-in-CUBE-Chip, bestehend aus einer Basiskomponente und einer Deckelkomponente, entworfen und durch einen Formprozess hergestellt. Die Form für die Basis enthielt ein Fach für den CUBE und zwei separate Medienkammern sowie eine Nut für den O-Ring; Die Form für den Deckel verfügt über zwei Anschlüsse zum Hinzufügen von Medien zu den beiden separaten Medienkammern (Abb. 2c(i)). Die Prozesse zur Herstellung des Chips sind in Abb. 2c(ii), (iii) dargestellt und im Abschnitt „Methoden“ beschrieben. Ein Zusatzfilm 1 zeigt, wie der CUBE in den Chip integriert wird.

FITC-Dextran und TRITC-Dextran wurden verwendet, um die Zugabe von zwei verschiedenen Arten von Medien zum CUBE zu simulieren, und es wurde eine tägliche Bildgebung durchgeführt, um den Fortschritt der dualen Gradientenbildung im CUBE über einen Zeitraum von 5 Tagen zu überwachen (Abb. 3a). ). Die durchschnittliche Konzentration (C) von FITC und TRITC im mittleren Bereich des Fensters des CUBE (x – x') wurde gemessen und zeigte einen entgegengesetzten Gradienten von hoher Konzentration auf der Quellenseite zu niedrigerer Konzentration auf der Senkenseite Die entsprechenden Dextranmoleküle bewegen sich von der Seite, wo es hoch konzentriert ist, zur gegenüberliegenden Seite, wo die Konzentration viel niedriger ist (Abb. 3b). Dem Quellreservoir wurden 10 μM Dextran zugesetzt, und die durchschnittliche maximale Konzentration am Quellenende des FOV betrug FITC = 2,618 μM und TRITC = 3,255 μM, während die minimale Konzentration am Senkenende FITC = 0,024 μM und TRITC betrug = 0,026 μM. Der Gradient wurde als Verhältnis von Ix0,2/Ix2,0 für FITC und Ix2,0/Ix0,2 für TRITC berechnet, wobei ein Wert von eins keinen Gradienten anzeigt und ein höheres Verhältnis einen steileren Gradienten darstellt (Abb. 3c). Die Steilheit des Gradienten nimmt zu und erreicht ihren Höhepunkt in den ersten 24 Stunden, wenn die Moleküle beginnen, in das Gel einzudringen. Wenn sich die Moleküle jedoch auf der gegenüberliegenden Seite sowie im Gel im WÜRFEL ansammeln, nimmt die Steilheit des Gradienten bis zum zweiten Tag ab Dennoch kann durch tägliches Spülen mit DPBS und Ersatz durch frisches Dextran ein konstanter Gradient 5 Tage lang aufrechterhalten werden, ohne dass die Medien einen Gleichgewichtszustand erreichen. In dieser Studie wurde nur die Diffusion von 40-kDa-Dextran in ein Agarosegel verwendet, um die Diffusion von Wachstumsfaktoren in ein ECM-Hydrogel zu modellieren. Diese wurden auf der Grundlage ausgewählt, dass das Molekulargewicht von Wnt, das eine wichtige Signalrolle bei der Entwicklung spielt, etwa 40 kDa beträgt und dass Dextran und Agarose leicht verfügbare Reagenzien sind, die in zahlreichen Massentransport- und Diffusionsstudien verwendet wurden. Aufgrund der großen Anzahl bekannter Morphogengradienten mit unterschiedlichen Molekulargewichten und der großen Auswahl an Hydrogelen, die für die Verwendung in Zellkulturen zur Verfügung stehen, war es nicht plausibel, die verschiedenen Permutationen von Morphogen- und Hydrogelpaarungen in der vorliegenden Studie zu untersuchen.

a Bildgebung des FITC- und TRITC-Dextran-Gradienten, der sich über einen Zeitraum von fünf Tagen bildet. Die Bildgebung wurde alle 24 Stunden durchgeführt, nachdem das verbrauchte Dextran entfernt, die Medienkammer mit DPBS gewaschen und frisches Dextran in die Kammer gegeben wurde. Die Abmessungen des Fensters des CUBE betrugen w = 2,75 mm; h = 3,5 mm und das Bildfeld bei 4-facher Vergrößerung betrug w = 3,6 mm; h = 2,7 mm. Maßstabsbalken = 1 mm. b Die Konzentration C wurde bestimmt, indem die durchschnittliche Intensität entlang der y-Achse für jedes Pixel im Mittelbereich (w = 2,2 mm; h = 2,2 mm) des Fluoreszenzbildes von x bis x' linear mit der von einem Standard erhaltenen Intensität korreliert wurde Kurvenanpassung der FITC- und TRITC-Dextran-Konzentrationen. Maßstabsbalken = 1 mm. Markierungen stellen ausgewählte Datenpunkte alle 50 Pixel (~0,3 mm) dar und Linien zeigen die beste lineare Anpassung nach der Methode der kleinsten Quadrate. n = 5. Die Steigungen der einzelnen Linien für FITC betrugen –0,0044 für Tag 0, –0,5586 für Tag 1, –0,5607 für Tag 2, –0,5549 für Tag 3, –0,5487 für Tag 4 und –0,5391 für Tag 5. Für TRITC, die Steigungen betrugen 0,0095 für Tag 0, 0,7644 für Tag 1, 0,7062 für Tag 2, 0,6504 für Tag 3, 0,5897 für Tag 4 und 0,6039 für Tag 5. Tag 0 zeigt einen geringen Gradienten, aber am Tag 1 ist ein Konzentrationsgradient zu erkennen wird von einem Ende des CUBE zum gegenüberliegenden Ende für FITC bzw. TRITC in entgegengesetzter Richtung erzeugt. c Das Verhältnis zwischen der Konzentration am Quellenende und der Konzentration am Senkenende wurde als Darstellung der Gradientensteilheit herangezogen. Der analysierte Bereich reichte von x = 0,2 mm bis x = 2,0 mm als ungefährer Bereich, in dem sich das Sphäroid befinden würde. Das Gefälle war am ersten Tag am steilsten, aber obwohl die Steilheit vom zweiten Tag an abnahm, kann das Gefälle fünf Tage lang konstant aufrechterhalten werden. d Die Differenzierung des hiPSC-Sphäroids mit Mesoderm-induzierendem Medium (M) auf der einen Seite und Neuroektoderm-induzierendem Medium (NE) auf der gegenüberliegenden Seite führt zu einem Sphäroid mit unterschiedlicher Morphologie an beiden Enden des Sphäroids, wohingegen die Morphologie bei M relativ einheitlich ist oder NE steuert nur. Maßstabsbalken = 500 μm.

Angesichts der Tatsache, dass ein Gradient über eine Skala von einer einzelnen oder einigen wenigen Zellenlängen ausreicht, um den Zellen Positionsinformationen zu liefern32,33, postulierten wir, dass der im Gradient-in-CUBE-Chip erzeugte Gradient ausreichen sollte, um eine lokalisierte Differenzierung auf der gegenüberliegenden Seite zu induzieren Enden eines Sphäroids. Darüber hinaus besteht eine weitere Strategie, um der Akkumulation von Morphogen entgegenzuwirken, darin, Inhibitoren des Morphogens auf der gegenüberliegenden Seite des Gradienten zu ergänzen, da das Zusammenspiel zwischen Morphogen und seinem Inhibitor auch für die Strukturierung in Geweben in vivo von entscheidender Bedeutung ist. Beispielsweise beschränken die Wnt- und Nodal-Antagonisten Dkk1, Lefty-1 und Cer-1 in den vorderen Teilen des Embryos Wnt/Nodal auf das hintere Ende des Embryos, um die anterior-posteriore Achse festzulegen34.

Um die Anwendung des Gradient-in-CUBE-Chips zur Differenzierung eines einzelnen Sphäroids in zwei lokalisierte Regionen zu demonstrieren, haben wir an einem Ende des CUBE ein Neuroektoderm-Differenzierungsmedium (NE) und an der gegenüberliegenden Seite ein Mesoderm-Differenzierungsmedium (M) bereitgestellt. Das Mesodermmedium (basierend auf einem Protokoll von Lam et al.35) enthielt hohe Konzentrationen des Wnt-Aktivators CHIR99021, wohingegen das Neuroektodermmedium (basierend auf einem Protokoll von Bianchi et al.36) einen niedrigeren Wnt-Aktivator zusammen mit dem Nodal/Activin-Inhibitor SB431542 enthielt um der Mesodermdifferenzierung auf der Neuroektodermseite entgegenzuwirken. Nach vier Tagen der Differenzierung konnten an beiden Enden des Sphäroids morphologische Unterschiede beobachtet werden, wobei die Mesodermseite ein holprigeres und stärker hervortretendes Merkmal aufwies, verglichen mit dem glatteren Merkmal der Neuroektodermseite. Im Gegensatz dazu zeigten die Kontrollsphäroide eher einheitliche morphologische Merkmale – die Mesodermkontrolle hatte auf der gesamten Oberfläche holprige Vorsprünge; Die Neuroektoderm-Kontrolle hatte eine glattere Oberfläche (Abb. 3d).

Aufgrund des begrenzten Laserdurchdringungsbereichs sowie der geringen Empfindlichkeit von Objektivlinsen mit geringer Vergrößerung und kurzen Brennweiten mit hoher Empfindlichkeit ist es oft schwierig, die Expression von Zellpluripotenz oder Differenzierungsmarkern in größeren 3D-Proben wie Organoiden zu visualisieren Linsen. Daher werden Organoide häufig in Kryomedium oder Paraffin eingebettet und zur Färbung und Bildgebung in dünne Schnitte geschnitten. Allerdings geht die Orientierung der Probe oft verloren, nachdem die Probe aus gängigen Gradientenerzeugungsgeräten entnommen wurde. Die Vorteile des CUBE-Geräts bestehen nicht nur darin, dass die Zellen im CUBE enthalten sind und entnommen werden können, ohne die Probe zu beschädigen, sondern auch darin, dass die Ausrichtung des Gradienten leicht markiert werden kann, um sie später zu erkennen. Hier zeigen wir, dass die Proben im CUBE für Kryo- und Paraffinschnitte verarbeitet werden können.

Beim Kryo-Schneiden dient der dickere Rahmen an einem Ende des CUBE, an dem der O-Ring befestigt war, als Orientierungsmarkierung. Nach der Entnahme der Probe aus dem Gradient-in-CUBE-Chip kann der CUBE vor dem Einfrieren einfach in Saccharose und Kryo-Einbettmedium eingeweicht werden. Nach dem Einfrieren wird der CUBE zusammen mit der Probe in Scheiben geschnitten, wobei der CUBE-Rahmen und die PDMS-Außenwand als Referenz dienen, um die Probenausrichtung beizubehalten (Abb. 2d(i) und 4a). Bei der Immunfluoreszenzfärbung des mit NE-M-Gradienten differenzierten hiPSC-Sphäroids wurde die Lokalisierung des Neuroektoderm-Markers Sox2 und des Mesoderm-Markers Brachyury an den jeweils gegenüberliegenden Enden des Sphäroids beobachtet, wohingegen in den Kontrollproben beide Marker gleichmäßig im gesamten Sphäroid exprimiert wurden (Abb. 4b). Somit haben wir eine Methode demonstriert, um die Orientierungsinformationen eines mit Morphogengradienten differenzierten Sphäroids zu bewahren, indem die Probe so geschnitten wird, wie sie im CUBE ist. Ein Nachteil dieser Methode besteht jedoch darin, dass die Mikrotomklinge durch wiederholtes Schneiden des harten Acrylmaterials beschädigt wird und möglicherweise häufig ausgetauscht werden muss. Dieses Problem kann durch die Verwendung eines weicheren und leichter zu schneidenden Materials für den CUBE-Rahmen gelöst werden, beispielsweise Polycarbonat oder Teflon. Alternativ könnten Sägemikrotome oder diamantbeschichtete Klingen, die üblicherweise zum Schneiden harter Proben wie Knochen verwendet werden, zum Durchschneiden des CUBE-Rahmens verwendet werden.

a Kryo-Schnitt und Bildgebung. (i) Schritte zum Einbetten und Schneiden gefrorener Proben mit CUBE, wobei der CUBE-Rahmen als Referenzmarkierung für die Probenorientierung verwendet wird. (ii) Die Immunfärbung von hiPSC-Sphäroiden, die mit einem M-NE-Gradienten differenziert wurden, zeigte ein lokalisiertes Expressionsmuster von Mesoderm- (Brachyury) und Neuroektoderm-Markern (Sox2), wohingegen nur NE- und M-nur-Kontrollen eine gleichmäßige Verteilung der Marker zeigten. b Paraffinschnitt und Bildgebung. (i) Schritte zum Einbetten und Schneiden von Paraffinproben mit dem CUBE-Halter, um Probenverlust zu verhindern, anschließendes Entfernen der Probe aus dem CUBE und Abschneiden einer Kante der Probe, um die Ausrichtung zu markieren. (ii) Die Immunfärbung von hiPSC-Sphäroiden, die mit einem Endoderm (END)-NE-Gradienten differenziert wurden, zeigte ein lokalisiertes Expressionsmuster von Endoderm- (FoxA2) und Neuroektoderm-Markern (Nestin), wohingegen nur NE- und nur END-Kontrollen eine gleichmäßige Verteilung der Marker zeigten.

Für das Paraffinschneiden müssen einige zusätzliche Schritte unternommen werden, um die Integrität und Gradientenorientierung der Probe im CUBE zu bewahren (Abb. 2d (ii) und 4b (i) sowie ergänzende Abb. 2). Während das Schneiden mit dem CUBE mit dem Kryo-CUBE erfolgen könnte, der aus einer Kombination aus Acrylrahmen und PDMS-Wand, einem weichen Material, besteht, ist es viel schwieriger, den Paraffin-CUBE zu schneiden, da der gesamte CUBE aus Acryl besteht. Dies war eine notwendige Änderung, da PDMS nicht mit organischen Lösungsmitteln kompatibel ist, die beim Paraffin-Einbettungsprozess verwendet werden. Während des anfänglichen Dehydrierungsprozesses vor der Paraffineinbettung verliert das Hydrogel stark an Volumen und schrumpft im WÜRFEL. Um das Risiko zu vermeiden, dass die Probe verloren geht und sich vom CUBE löst, wurde ein CUBE-Halter bestehend aus einem Deckel und einer Basis entwickelt, der die meisten offenen Ober- und Unterseiten des CUBE abdeckt, aber dennoch den Durchgang von Reagenzien ermöglicht die Probe. Der WÜRFEL im Halter wurde dann mit einem Draht zusammengebunden, um ihn zusammenzuhalten. Nach dem Paraffinisierungsprozess wurde die Probe mit einer Schiebevorrichtung aus dem WÜRFEL entnommen und die Ausrichtung durch Schneiden einer Kante an einer Ecke der Probe markiert. Um die Anwendung der Paraffinmethode zu demonstrieren, wurde hiPSC-Sphäroid mit NE- und Endoderm-(END)-Differenzierungsmedien (basierend auf einem Protokoll von Lam et al.35) auf beiden Seiten des CUBE differenziert. Die Immunfluoreszenzfärbung der Neuroektodermmarker Nestin und Sox2 sowie der Endodermmarker FoxA2 und Sox17 zeigte eine Lokalisierung auf der NE- bzw. END-Seite der Sphäroide (Abb. 4b (ii) und ergänzende Abb. 3). Andererseits zeigten Kontrollproben ohne Gradientenkultur eine gleichmäßige Expression der Marker im gesamten Sphäroid.

Die FITC/TRITC-Dextran- und NE/M- sowie END/NE-Differenzierungsexperimente zeigten hier, dass Morphogengradienten im CUBE erzeugt und zur Steuerung der Differenzierung von Zellsphäroiden verwendet werden können. Es ist jedoch zu beachten, dass der von der in diesem Artikel vorgestellten Plattform erzeugte Gradient nur auf der freien Diffusion von Molekülen von der Quelle über das Gel im CUBE zur Senke beruht. Da die Geschwindigkeit der freien Diffusion von der Größe, Ladung und Löslichkeit des gelösten Stoffes37 sowie der Porengröße, Ladung und Polymermobilität der Hydrogelmatrix38 abhängt, sind detaillierte experimentelle oder Simulationsstudien unter Berücksichtigung der spezifischen Morphogenerzeugung erforderlich Molekül, die Diffusionsfähigkeit jedes Moleküls und wie Hydrogeleigenschaften die Diffusion jedes Moleküls beeinflussen39,40,41,42,43,44,45 kann notwendig sein, um die kleinsten Details des Massentransports zu verstehen und eine noch feinere Kontrolle der Gradientenerzeugung zu erreichen, aber Dieses Maß an Präzision würde den Rahmen dieser Studie sprengen. Alternativ ist die Sicherstellung einer konstanten Konzentration von Wachstumsfaktoren im Medium eine Möglichkeit, die Genauigkeit des Gradienten besser zu steuern, beispielsweise durch häufigeres Wechseln oder Mischen des Mediums oder durch Pumpen eines konstanten Flusses frischen Mediums zur Probe Diese Methoden würden die Einrichtungs- und Kulturverfahren komplizierter machen.

Die Rolle und Mechanismen von Morphogengradienten bei der Steuerung des Zellschicksals sind komplex und noch nicht vollständig verstanden. Wenn Zellen sich selbst organisieren, um spezifische Muster des Gewebes zu bilden, werden sowohl lokale Gradienten, die durch Sekrete der Zellen selbst und ihrer unmittelbar umgebenden Nachbarn erzeugt werden, als auch externe Gradienten in der die Zellen umgebenden ECM, die durch weiter entfernte Zellen erzeugt werden, wie z diejenigen im umgebenden Mesenchym tragen zur Steuerung der Zelldifferenzierung bei15,16. Theoretische Modelle wie die Reaktions-Diffusions-, Positionsinformations- (französische Flagge) oder Synthese-Diffusions-Clearance-Modelle wurden verwendet, um die kurz- und fernreichenden Wechselwirkungen zwischen Zellen und Morphogen und die daraus resultierende Musterbildung zu erklären oder vorherzusagen29,45, 46, aber diese Studien konzentrieren sich auf die lokale Umgebung der Zellen. Andererseits zielt die CUBE-Gradientenplattform darauf ab, die Bereitstellung externer Gradienten durch andere Zellpopulationen in der Peripherie nachzuahmen, die eine Rolle bei der Bildung der Strukturen höherer Ordnung von Organen spielen, beispielsweise bei den Verzweigungsmustern von Brustdrüse und Niere , oder Lunge47,48,49. Daher wäre eine detaillierte Optimierung der Interaktion zwischen Zellen und Gradienten verschiedener Morphogene sowie des Zeitpunkts der Gradientenbildung erforderlich, um spezifische Zielorganoide mit dem gewünschten Muster zu entwickeln. Darüber hinaus würden, obwohl die an beiden Enden der Kontrollproben hinzugefügten Wachstumsfaktoren genau die gleichen wären, auch Gradienten der Wachstumsfaktoren auftreten, wenn sie von den entgegengesetzten Enden in das Gel eintreten, und längerfristige Studien darüber, wie sich dies auf das Selbst auswirken könnte -In Zukunft wäre eine Organisation von Zellen in größeren und kleineren Sphäroiden erforderlich.

Da das CUBE- und Gradienten-Chip-Design an die Bedürfnisse des Benutzers angepasst werden kann, könnte die Plattform auch für die Entwicklung hochkomplexer Organoide geeignet sein, beispielsweise durch die Anwendung von Gradienten auf vier Seiten des CUBE, um Organoide mit anterior-posteriorer und dorsal-ventraler Achse zu erzeugen .

Einer der größten Nachteile der Verwendung von PDMS zur Herstellung des Gradientenchips ist die Absorption von Proteinen und kleinen Molekülen an der PDMS-Oberfläche aufgrund ihrer hydrophoben Natur50,51,52. Dennoch bietet PDMS zahlreiche Vorteile wie Biokompatibilität, Gasdurchlässigkeit, optische Transparenz und einen einfachen Herstellungsprozess. Es gibt auch mehrere relativ einfache Methoden, die die Proteinabsorption reduzieren sollen, darunter das Mischen von PDMS mit Polyethylenglykol (PEG) zur Erhöhung der Hydrophilie von PDMS53 oder die Beschichtung von Oberflächen mit Teflon, 2-Methacryloyloxyethylphosphorylcholin (MPC)-Polymer oder Paraffin Wachs54,55,56.

Obwohl die Immunfluoreszenzfärbung der Differenzierungsmarker eine lokalisierte Differenzierung des Sphäroids zeigt, variieren Struktur und Morphologie jeder Probe, wie beispielsweise im Fall der Endodermkontrolle in Abb. 4b(ii). Ein möglicher Grund für diese Variation ist, dass die Positionierung des Zellsphäroids zwar kontrolliert wird, das anfängliche Sphäroid jedoch in einer 96-Well-Platte ohne Kontrolle der Sphäroidform gebildet wird. Da in mehreren Studien über den Beitrag geometrischer Einschränkungen bei der Nachahmung von Mustern und symmetriebrechenden Entwicklungsereignissen in In-vitro-Kulturen57,58 berichtet wird, könnte es in Zukunft besser sein, die Formkappenmethode anzuwenden, um einzelne Zellen vor der Sphäroidbildung im 3D-Hydrogel zu positionieren Kontrollieren Sie die anfängliche Keimform, indem Sie beispielsweise die gewünschte geometrische Form mit Kohlenhydratglas in 3D drucken und das Kohlenhydrat auflösen, nachdem das Gel ausgehärtet ist, um eine Keimtasche mit der entsprechenden gewünschten Form zu hinterlassen59.

Ein Vorteil der Modularität des CUBE- und Chipdesigns besteht darin, dass die Materialauswahl entsprechend den Anforderungen der Experimente ausgewählt werden kann. Steht beispielsweise die optische Transparenz im Vordergrund, ist ein CUBE mit PDMS-Fenster besser geeignet; Wenn hingegen eine Paraffinierung der Probe für die Analyse nach dem Experiment erforderlich ist, ist ein vollständig aus Acryl gefertigter CUBE ohne PDMS besser geeignet, auch wenn die optische Klarheit aufgrund der Inkompatibilität von PDMS mit organischen Lösungsmitteln leicht eingeschränkt ist. Dementsprechend muss die Materialauswahl für den Gradientenchip nicht mit der des CUBE identisch sein und sollte unter Berücksichtigung der Vor- und Nachteile des Materials ausgewählt werden60,61.

Die Kultivierung von 3D-Organoiden mit einem Morphogengradienten war lange Zeit eine Herausforderung, sowohl im Hinblick auf die komplizierte Einrichtung des Gradientengeräts als auch auf die Aufrechterhaltung der Ausrichtung des Gradienten während der Analyseprozesse. In diesem Artikel stellen wir einen Workflow von der Gradientenkultur zur Bildgebung vor, der das modulare CUBE-Kulturgerät nutzt, um einfach ein Gradient-in-CUBE-Gerät einzurichten. Im Vergleich zu Gradienten, die in Standard-Mikrofluidchips erzeugt werden, die dynamisch mithilfe von Fluss und Druck gesteuert werden können, ist der mit unserem einfachen Gradientengerät erzeugte Gradient im Laufe der Zeit weniger kontrollierbar, da er nur auf der freien Diffusion von Molekülen beruht. Die hier vorgestellte Plattform konzentriert sich jedoch auf die Benutzerfreundlichkeit für Biologen und erfordert keine komplizierte Einrichtung mit Pumpen oder Spritzen. Darüber hinaus würde die Kommerzialisierung des CUBE mit verschiedenen Modifikationen, um den Anforderungen der Benutzer gerecht zu werden, die Benutzerfreundlichkeit und Akzeptanz der CUBE-Plattform durch weniger technisch versierte Labore weiter erhöhen, genau wie die vorherige Iteration des CUBE kommerziell verfügbar gemacht wurde. Darüber hinaus kann die Probe nach dem Experiment leicht aus dem Gerät entfernt werden, ohne die Probe zu beschädigen, während die Informationen über die Richtung, in der der Gradient gebildet wurde, erhalten bleiben. Obwohl eine zusätzliche zielorganoidabhängige Optimierung der Kulturprotokolle erforderlich sein kann, um die am besten geeigneten Gradientensteigungen für bestimmte Wachstumsfaktoren im ausgewählten unterstützenden ECM-Material zu bestimmen, haben die einfachen und anpassbaren Methoden in diesem Artikel das Potenzial, die Organoidentwicklung durch Symmetriebrechung erheblich voranzutreiben .

Ein interessanter Punkt, der in zukünftigen Arbeiten berücksichtigt werden sollte, ist jedoch der potenzielle Beitrag von Unterschieden in der mechanischen Stimulation, die Zellen je nach Größe der Sphäroide im Verhältnis zur Größe der durch die Formkappe erzeugten Saattasche erfahren, da die Abdichtung der Eine Tasche mit zusätzlichem Hydrogel kann aufgrund von überschüssigem Medium in der Tasche, wenn Sphäroide darin ausgesät werden, zu einer gewissen Variation der Gelsteifigkeit führen. Die Gradient-in-Cube-Plattform in ihrer aktuellen Form erzeugt nur Gradienten in einer Richtung, kann aber auch so angepasst werden, dass sie Gradienten in zwei Achsen erzeugt, beispielsweise der anterior-posterioren und der dorsal-ventralen Achse im selben Organoid , das sind Arbeiten, die derzeit durchgeführt werden. Daher könnte der Arbeitsablauf von der Erzeugung von Organoiden mit lokalisierter Differenzierung bis zur Analyse mit Gradienteninformationen Forschern eine benutzerfreundliche Methode zur Entwicklung immer komplexerer Organoide bieten, um unser Verständnis verschiedener Mechanismen wie Symmetriebrechungen zu erweitern, die an Entwicklungsprozessen beteiligt sind.

Menschliche iPSCs (IMR90-4; WiCell Research Institute; WB65317) wurden mit mTeSR Plus (STEMCELL Technologies, 100-0276) auf Schalen gehalten, die mit 9–10 μg/cm2 Growth Factor Reduced Matrigel (Corning, 356231) beschichtet und routinemäßig mit ReLeSR passagiert wurden (STEMCELL Technologies, 05872) und in einem Inkubator bei 37 °C und 5 % CO2 kultiviert. Die Zellen wurden mit dem MycoAlert-Kit (Lonza, LT07-118) auf Mykoplasmenkontamination getestet. Um 96-Well-Platten für die Sphäroidbildung vorzubereiten, wurden die Wells mit 80 μl/Well 3 % Agarose (Sigma, A9414) gefüllt und erstarren gelassen. StemFit AK02N-Medium (Ajinomoto, RC AK02N) plus 10 μM Rock-Inhibitor (Y-27632; Nacalai Tesque, 08945-84) wurde dann in die Vertiefung gegeben und inkubiert. Zur Sphäroidbildung wurden 70 % der konfluenten Zellen mit ReLeSR dissoziiert und nach der Zentrifugation in StemFit +Y27632-Medium resuspendiert, bevor sie in Agarose-Wellplatten ausgesät wurden. Aus Zellen einer 35-mm-Schale wurden 5 Sphäroide hergestellt (ungefähr 2–3 × 104 Zellen pro Sphäroid). Am nächsten Tag wurde das Medium auf mTeSR Plus-Medium ohne Y27632 umgestellt. Sphäroide wurden nach einem Tag Kultur in mTeSR Plus auf das CUBE-Gerät übertragen.

Die Materialauswahl für den CUBE musste sorgfältig überlegt werden, um den Anforderungen jedes einzelnen Verfahrens gerecht zu werden, insbesondere da der Paraffinierungsprozess die Verwendung organischer Reagenzien erfordert. Der CUBE-Rahmen wurde vom bisher verwendeten Polycarbonat auf Acrylmaterial umgestellt, das im Vergleich zu Polycarbonat widerstandsfähiger gegen kurzzeitige Xylol-Behandlung ist. Darüber hinaus wurde Polydimethylsiloxan (PDMS), ein klares biokompatibles Material auf Silikonbasis, als Seitenwandmaterial verwendet, um die Bewegung morphogenhaltiger Medien durch den WÜRFEL nur auf die Ober- und Unterseite des WÜRFELS zu beschränken und so einen Gradienten nur in einer Achse zu erzeugen des CUBE.

Für diese Studie wurden zwei Arten von Acrylwürfeln (Poly(methylmethacrylat); PMMA) mit der Rhinoceros 3D-Software (Robert McNeel & Associates) entworfen. Für Kryo-Schnitte wurden CUBEs mit einem dickeren Rahmen auf der Oberseite des Würfels entworfen, sodass ein Nitril-O-Ring (AS ONE, 62-3049-63) am Würfel befestigt werden kann (Abb. 2a(i)). Wasserdichte Abdichtung, um das Austreten von Medien rund um den Würfel während der Gradientenkultur zu reduzieren. Um die Seitenwände des Cryo CUBE herzustellen, wurde zunächst PDMS (Silpot 184, Dow Toray, 04133124) hergestellt, indem Elastomerbasis mit Härtungsreagenz im Verhältnis 10:1 gemischt wurde. Dann wurde eine dünne Schicht der Mischung in einer Petrischale ausgebreitet und entgast, um Luftblasen zu entfernen. Die Würfelrahmen wurden auf das PDMS gelegt, dann erneut entgast und 30 Minuten lang bei 85 °C gebacken, um das PDMS auszuhärten. Nach dem Aushärten wurde das PDMS mit einem Skalpell von den Rahmen abgeschnitten und der Vorgang wiederholt, um die anderen drei Seiten des Würfels abzudecken, wobei die Ober- und Unterseite offen blieben (Abb. 2a(ii)). Die Dicke der PDMS-Wand entspricht der Dicke des CUBE-Rahmens, die 0,75 mm beträgt, wenn ~2,8 g PDMS pro 100-mm-Schale verwendet wurden. Da PDMS bei Einwirkung von Xylol aufquillt, wurden CUBEs für Paraffinschnitte ohne Seitenwände entworfen (Abb. 2a (i)). Obwohl dadurch die Klarheit der Proben leicht beeinträchtigt wird, bietet ein vollständig aus Acryl gefertigter Rahmen immer noch eine ausreichende Sichtbarkeit im Hellfeld. Für das Paraffinschneiden wurden CUBEs als massiver Würfel mit einer Länge von 5 mm und einem Hohlkern von 3,5 × 3,5 mm konzipiert, wobei die Dicke des Rahmens 0,75 mm betrug (Abb. 2a (i)). WÜRFEL zum Paraffinschneiden hatten keine PDMS-Seitenwände, da PDMS während des Paraffinisierungsprozesses in Xylol aufquillt. Alle CUBEs wurden bei Bearbeitungsunternehmen bestellt (Cryo CUBEs von Yumoto Electric Inc, Japan und Paraffin CUBEs von Proto Labs, Japan). Vor der Verwendung wurden die CUBEs zweimal mit Ultraschall gewaschen, einmal mit MilliQ-Wasser und einmal mit Isopropanol (IPA), und dann 2 Stunden lang im Ofen getrocknet.

Um die Positionierung der Zellen während der ersten Aussaat im WÜRFEL zu kontrollieren, wurde eine Formkappe mit einer Säulenstruktur an der gewünschten Aussaatposition und mit Rillen entworfen, um sicherzustellen, dass die Form auf die Oberseite des Würfels passt, sodass die Säulenposition ausgerichtet werden kann richtig im Würfel (Abb. 2b(i)). Die Formkappen wurden mit einem 3D-Drucker (Agilista 3200, Keyence) gedruckt und nach dem Entfernen überschüssigen Druckträgermaterials zweimal durch Ultraschall mit IPA gereinigt und anschließend in einem Ofen bei 65 °C getrocknet. Vor der Verwendung wurde die Formkappe in 2-Methacrylooyloxtethylphosphorylcholin (MPC; Lipidure, NOF Corporation, CM5206E), verdünnt auf 5 % in Isopropanol, getaucht und dann 1 Stunde bei Raumtemperatur (RT) trocknen gelassen. Die MPC-Beschichtung trägt dazu bei, dass sich die Form leichter vom Hydrogel löst. Ein Nitril-O-Ring wurde am dicken Teil des Acrylrahmens für den Cryo CUBE angebracht, also etwa 1 mm nahe einem Ende des Paraffin CUBE. Die WÜRFEL wurden mit der O-Ring-Seite nach unten in eine Schale gelegt und Matrigel in den WÜRFEL gegeben, bevor die Formkappe auf den WÜRFEL gesetzt und das Gel 25 Minuten lang im Inkubator ausgehärtet wurde. Sobald das Gel ausgehärtet war, wurde die Formkappe entfernt und hiPSC-Sphäroide in die durch die Form entstandene Tasche gesät. Als nächstes wurde zusätzliches Matrigel oben auf den WÜRFEL gegeben und weitere 25 Minuten aushärten gelassen, um die Tasche abzudichten (Abb. 2b(ii)). Nach dem Aushärten wurde der CUBE auf eine 48-Well-Platte mit mTeSR Plus-Medium übertragen und vor Beginn der Gradientenkultur 2 Stunden lang inkubiert.

Formen zur Herstellung von Deckeln aus PDMS-Gradientenchips wurden mit Rillen für den O-Ring und Anschlüssen zum Hinzufügen von Medien entworfen, während die Basis für den Würfel, den O-Ring und zwei separate Medienkammern ausgelegt war (Abb. 2c(i)) ). PDMS-Formen wurden bei Proto Labs bestellt. Zur Herstellung der PDMS-Chips wurde ungehärtetes PDMS in die Formen gegossen, dann entgast und 1 Stunde lang bei 85 °C gebacken, um das PDMS auszuhärten. Nach dem Aushärten wurden die Chips aus den Formen genommen, dann gewaschen und auf die gleiche Weise wie die CUBEs sterilisiert. Um den Gradientenchip zusammenzubauen, wurden CUBEs in der Chipbasis platziert, wobei der O-Ring in die O-Ring-Nut passte, und eine doppelseitige PDMS-Klebefolie (NSD-100, NIPPA) mit Löchern für den Zugang zu den Medienkammern eingeschnitten Es wurde verwendet, um den Deckel und die Basis miteinander zu versiegeln (Abb. 2c(ii)). Nach dem Zusammenbau wurden die Medienkammern auf jeder Seite des CUBE mit den jeweiligen Differenzierungsmedien gefüllt (Abb. 2c (iii)).

Das Neuroektoderm-Differenzierungsmedium bestand aus einer 1:1-Mischung aus KnockOut DMEM/F12 (Gibco, 12660-012) und Neurobasal-Medium (Gibco, 21103-049), ergänzt mit 10 % KnockOut-Serumersatz (Gibco, 10828010) und 1 % nicht-essentiellem MEM-Amino Säure (Nacalai Tesque, 06344-56), 1% Glutamax (Gibco, 35050-061), 1 μm Ldn1913189 (Sigma, Sml0559), 2 & mgr; M SB431542 (NACALAI TESQUASKE, 18176-54). -44), 0,1 mM 2-Mercaptoethanol (Nacalai Tesque, 21438-82) und 0,5 μM Ascorbinsäure (Nacalai Tesque, 03420-52). Mesendoderm-Basalmedium umfasste RPMI-Medium 1640 (Gibco, 11875-093), 1 % GlutaMAX und 1 % Penicillin-Streptomycin (Gibco, 15140122). Zur Mesodermdifferenzierung wurden an den Tagen 0 und 1 5 μM CHIR99021 dem Mesendoderm-Basalmedium zugesetzt. Von den Tagen 2 bis 4 wurde CHIR99021 entfernt und durch 100 ng/ml bFGF (Nacalai Tesque, 19155–36) und 1 μM all-trans ersetzt Retinsäure (Stemgent, 04-0021). Zur Differenzierung des Endoderms wurden am Tag 0 5 μM CHIR99021 dem Mesendoderm-Basalmedium zugesetzt, und am Tag 2 bis 5 wurde CHIR99021 entnommen und durch 100 ng/ml Activin A (R&D Systems, 338-AC-050/CF) ersetzt. Der Medienwechsel wurde jeden Tag durchgeführt, indem verbrauchte Medien verworfen, einmal mit DPBS gewaschen und durch frische Medien ersetzt wurden. Phasenkontrastbilder der Sphäroide im CUBE im Chip-Gerät wurden mit dem Olympus CKX41-Mikroskop aufgenommen, um morphologische Veränderungen am Sphäroid zu überwachen.

Zum geeigneten Zeitpunkt für die Analyse wurden die Proben vom Gradientenchip entfernt und zur Fixierung auf eine 48-Well-Platte übertragen. Die Proben wurden jeweils zweimal 5 Minuten lang mit DPBS gewaschen, 20 Minuten lang mit 4 % Paraformaldehyd fixiert und dann jeweils zweimal 10 Minuten lang mit DPBS gewaschen. Für die Kryo-Schnitte wurden die Proben nacheinander jeweils 1 Stunde lang in 10 %, 15 % und 20 % Saccharose (Wako, 194-00011) und anschließend in Kryo-Schnitt-Einbettungsmedium (Tissue-Tek OCT Compound; Sakura Finetek, 4583) eingeweicht 10 Minuten vor dem Einbetten in Einbettmedium und Einfrieren bei –80 °C für 30 Minuten. Nach dem Einfrieren wurden die Proben aus der Form entnommen und mit einem Mikrotom (Yamato Kohki Industrial, Retoratome REM-710), das mit einer Gefriereinheit (Yamato Kohki Industrial) ausgestattet war, wie beim CUBE (Abb. 2d(i)) mit einer Dicke von 30 μm geschnitten , Electro Freeze MC-802A). Auf Glasobjektträgern gesammelte Schnitte wurden 30 Minuten lang mit kalter Luft und dann weitere 30 Minuten lang in einem Ofen bei 40 °C getrocknet und anschließend in MilliQ-Wasser gewaschen, um überschüssiges Einbettungsmedium zu entfernen. Überschüssiges Wasser wurde entfernt und die Schnitte 10 Minuten bei RT getrocknet.

Zum Paraffinschneiden wurden die Proben dehydriert und nach dem folgenden Verfahren in Paraffin eingebettet: 70 % Ethanol für 2 Stunden, 70 % Ethanol über Nacht, 80 % Ethanol für 1 Stunde, 95 % Ethanol für 1 Stunde, 99 % Ethanol für 1 Stunde, 100 % Isopropanol für 1 Stunde zweimal, 100 % Xylol für 1 Stunde dreimal, 1:1-Mischung aus Xylol und Paraffin (Nacalai Tesque, 26029-05) über Nacht bei 40 °C und Paraffin für 1,5 Stunden dreimal bei 65 °C. Um den Verlust der Probe aufgrund der Schrumpfung von Matrigel während des Dehydrierungsprozesses zu verhindern, wurde ein CUBE-Halter mit Deckel und Boden, der durch Draht zusammengehalten wird, entwickelt, um die Probe im CUBE zu halten (Abb. 2d(ii)). Nach dem letzten Paraffinschritt wurde die Probe aus dem CUBE-Halter entnommen und in frisches Paraffin eingebettet. Der WÜRFEL wurde aus dem Paraffin herausgeschnitten und die Probe aus dem WÜRFEL entfernt, indem das Paraffin mit einem Skalpell entlang des inneren Rahmens des WÜRFELs geschnitten und der WÜRFEL auf eine Schiebevorrichtung gedrückt wurde (Abb. 2d (ii)). Eine Kante der paraffinisierten Probe wurde geschnitten, um die Ausrichtung der Gradientenrichtung zu markieren, und die Probe wurde mit einem Mikrotom in 10 μm dicke Scheiben geschnitten. Die Entparaffinierung wurde wie folgt durchgeführt: 100 % Xylol zweimal für 10 Minuten, 99 % Ethanol zweimal für 5 Minuten, 95 % Ethanol für 5 Minuten, 80 % Ethanol für 5 Minuten, 70 % Ethanol für 5 Minuten, MilliQ-Wasser für 5 Minuten. Die hitzeinduzierte Antigengewinnung wurde durchgeführt, indem die Proben in 10 mM Citratpuffer (1,8 mM Zitronensäure, 8,2 mM Trinatriumcitrat, pH 6) gegeben und der Puffer erhitzt wurde, bis er siedete, und dann 1 Minute lang abgekühlt wurde. Der Siede- und Abkühlvorgang wurde 6 Mal mit 10 Sekunden Siedezeit und anschließender 1 Minute Abkühlung wiederholt. Nach dem letzten Zyklus wurden die Proben 30 Minuten lang gekühlt, dann 5 Minuten lang mit MilliQ-Wasser und anschließend dreimal 5 Minuten lang mit DPBS gewaschen.

Kryogeschnittene Proben wurden mit 0,5 % Triton X-100 für 10 Minuten permeabilisiert, gefolgt von drei Waschungen mit 100 mM Glycin für jeweils 10 Minuten. Der Immunfluoreszenzpuffer (IF-Puffer) bestand aus 0,5 % Tween20, 2 % Triton X-100 und 10 % Rinderserumalbumin (BSA; Sigma, 126615) in DPBS. Die Blockierung erfolgte durch Inkubation der Proben mit IF-Puffer mit 10 % Ziegenserum (Gibco, 16210064) (IF + G) für 30 Minuten, dann IF + G mit 1 % Ziegen-Anti-Maus-IgG (Bethyl Laboratories, A90-116A) für 20 Minuten Mindest. Die Antikörper wurden gemäß Ergänzungstabelle 1 verdünnt (1:200 oder 1 μg/ml). Primärantikörper wurden 90 Minuten lang und Sekundärantikörper (Alexa fluor, 1:200, Thermo Fisher Scientific) 50 Minuten lang inkubiert. Nach jeder Antikörperinkubation wurden die Proben dreimal 15 Minuten lang mit IF-Puffer gewaschen. Die Kerne wurden 20 Minuten lang mit DAPI gefärbt und dann dreimal 5 Minuten lang mit DPBS gewaschen.

Um die Bildung des Gradienten über einen bestimmten Zeitraum zu verfolgen, wurde ein mit 1,5 % Agarose gefüllter CUBE mit 10 μM 40 kDa Fluoresceinisothiocyanat (FITC)-Dextran (Sigma, FD40S) in DPBS an einem Ende des CUBE in den Gradientenchip gegeben. und 10 μM 40 kDa Tetramethylrhodamin-B-Isothiocyanat (TRITC)-Dextran (TdB Labs, TD40) in DPBS am anderen Ende. Alle 24 Stunden wurden sowohl FITC-Dextran als auch TRITC-Dextran verworfen und die Medienkammern einmal mit DPBS gewaschen, bevor sie durch frisches Dextran ersetzt wurden. Nach diesen Schritten wurde die Abbildung am Fenster des CUBE (B = 2,75 mm; H = 3,5 mm) unter Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops (BZX-700, Keyence) bei 4-facher Vergrößerung (Sichtfeld: B = 3,6 mm; H) durchgeführt = 2,7 mm). Die Fensterfläche des CUBE war in x-Richtung 1,5 mm von der Quelle auf der FITC-Seite und 0,75 mm von der Quelle auf der TRITC-Seite entfernt; 0,75 mm von der CUBE-Wand in y entfernt; und 2,5 mm vom Boden des WÜRFELS entfernt in z. FITC- und TRITC-Intensitäten wurden aus Fluoreszenzbildern mit dem Plot Profile-Tool in der ImageJ-Software über einen Bereich in der Bildmitte (B = 2,2 mm; H = 2,2 mm) gemessen, was die durchschnittliche Intensität entlang der vertikalen y-Achse für angibt jedes Pixel auf der x-Achse. Die Konzentration (C) wurde dann durch Linerkorrelation mit einer Standardkurve der FITC- und TRITC-Dextran-Intensitäten verschiedener Konzentrationen berechnet (Ergänzungsdaten 1). Der Gradient wurde als Verhältnis der Konzentrationen bei 0,2 mm und bei 2,0 mm (Cx0,2/Cx2,0 für FITC und Cx2,0/Cx0,2 für TRITC) berechnet, um die Bereiche an beiden Enden des CUBE-Fensters auszuschließen da die Nähe zum CUBE-Rahmen die Intensität des Dextrans beeinflusste und den ungefähren Bereich des Sphäroids darstellte.

Alle Stichprobengrößen sind größer als fünf und werden in den Abbildungslegenden angegeben. Der p-Wert wurde durch den Kolmogorov-Smirnov-Test (KS) in Matlab berechnet.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich. Die Quelldaten, die Abb. 3c und der ergänzenden Abb. 1c zugrunde liegen, sind in den ergänzenden Daten 1 aufgeführt.

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Diese Forschung wurde durch Mittel der JSPS KAKENHI Grant-Nummern 21H01299 und 21K18048 unterstützt. Einige Illustrationen wurden mit Biorender erstellt.

Cluster für bahnbrechende Forschung, RIKEN, Saitama, 351-0198, Japan

Elizabeth Koh und König Hagiwara

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IK und MH konzipierten die Studie, konzipierten und führten Experimente durch und analysierten die Ergebnisse. IK hat das Manuskript geschrieben. Alle Autoren haben das eingereichte Manuskript gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit Masaya Hagiwara.

Die Autoren sind Inhaber der folgenden Patente: (i) Bezogen auf das CUBE-Gerät – Genehmigt: 6877009 (Japan), US 11,155,775 B2 (USA); Ausstehend: 201680069487.6 (China); Antragsteller: Osaka Metropolitan University und Kyushu Institute of Technology; Erfinder: Masaya Hagiwara und Tomohiro Kawahara, (ii) Bezogen auf CUBE-Gerät und Fluidgerät – Genehmigt: 7055386 (Japan); Ausstehend: 16/484.506 (USA), 16/484.506 (EP); Antragsteller: Osaka Metropolitan University; Erfinder: Masaya Hagiwara, (iii) Bezogen auf das Schneiden des CUBE-Geräts – Ausstehend: 2022-140997 (Japan); Antragsteller: RIKEN; Erfinder: Masaya Hagiwara, Isabel Koh. Das Patent 6877009 ist an Nippon Medical & Chemical Instruments Co., Ltd. lizenziert.

Communications Biology dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptverantwortliche Redakteure: Marco Fritzsche, Manuel Breuer.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Koh, I., Hagiwara, M. Übergang zum CUBE-Workflow zur Schnittdarstellung für die Erzeugung und Abbildung von Organoiden mit lokalisierter Differenzierung. Commun Biol 6, 299 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04694-5

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Eingegangen: 27. September 2022

Angenommen: 10. März 2023

Veröffentlicht: 21. März 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04694-5

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