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Jun 09, 2023

Kombi

Band Nature Communications

Nature Communications Band 13, Artikelnummer: 4450 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Details zu den Metriken

Krebstherapien zeigen oft nur kurzfristige Wirkungen. Tumoren entwickeln typischerweise eine Arzneimittelresistenz, die zu Rückfällen führt, die mit Arzneimittelkombinationen bekämpft werden können. Die Identifizierung der richtigen Kombination ist eine Herausforderung und würde von kombinatorischen Screenings mit hohem Inhalt und hohem Durchsatz direkt an Patientenbiopsien profitieren. Allerdings erfordern solche Screenings eine große Menge an Material, das den Patienten normalerweise nicht zur Verfügung steht. Um diesen Herausforderungen zu begegnen, stellen wir einen skalierbaren mikrofluidischen Arbeitsablauf namens Combi-Seq vor, um Hunderte von Arzneimittelkombinationen in Tröpfchen in Pikolitergröße zu screenen und dabei Transkriptomänderungen als Messwert für Arzneimittelwirkungen zu verwenden. Wir entwickeln einen deterministischen kombinatorischen DNA-Barcoding-Ansatz zur Kodierung von Behandlungsbedingungen, der das auf der Genexpression basierende Auslesen von Arzneimittelwirkungen auf hochmultiplexte Weise ermöglicht. Wir verwenden Combi-Seq, um die Wirkung von 420 Arzneimittelkombinationen auf das Transkriptom von K562-Zellen zu untersuchen, wobei wir nur etwa 250 einzelne Zelltröpfchen pro Bedingung verwenden, um erfolgreich synergistische und antagonistische Arzneimittelpaare sowie deren Signalwegaktivitäten vorherzusagen.

Trotz großer Fortschritte in den letzten Jahrzehnten bleibt Krebs eine der häufigsten Todesursachen. Unser verbessertes molekulares Verständnis der molekularen Grundlagen von Krebs hat zur Entwicklung gezielter Therapien geführt. Diese Therapien haben bisher nur eine begrenzte Wirksamkeit und nur bei einer kleinen Untergruppe von Patienten gezeigt1, trotz großer Anstrengungen, Patienten genomisch zu charakterisieren, um Biomarker für die Reaktion zu finden.

Ein Ansatz, der verspricht, diese Situation zu verbessern, besteht darin, das großgenomische Profiling bei Grundbedingungen durch Messungen nach der Störung von Krebszellen mit Medikamenten zu ergänzen2. Während viele Ansätze für die Durchführung von Arzneimittelscreenings verwendet werden können, sind sie oft von geringem Durchsatz3, kosten- und zeitintensiv4 und/oder erfordern große Mengen an Zellen5, was zusammengenommen die Anzahl potenzieller Arzneimittel, die pro Tumorbiopsie untersucht werden können, stark einschränkt. Diese Einschränkung wird bei der Betrachtung von Arzneimittelkombinationen noch deutlicher, da die schiere Anzahl möglicher Kombinationen mit der Anzahl der getesteten Arzneimittel exponentiell zunimmt.

Aufgrund begrenzter Screening-Kapazitäten wurden rechnerische Ansätze zur Modellierung von Arzneimittel-Arzneimittel-Wechselwirkungen entwickelt6. Während sich die Modelle zur Arzneimittelwirksamkeit in den letzten Jahren durch eine Zunahme der verfügbaren Datenressourcen verbessert haben, bleiben Vorhersagen über Arzneimittelreaktionen schwierig und auf gut charakterisierte Systeme wie Zelllinien beschränkt, wodurch ihre Übertragbarkeit in die Klinik eingeschränkt wird. Unter den verschiedenen Datentypen erwies sich der Genexpressionsstatus von Zellen als äußerst prädiktiv für die Arzneimittelreaktion7. Darüber hinaus haben sich Datenspeicher zu medikamenteninduzierten Transkriptionsänderungen wie LINCS8 als wertvolle Ressource erwiesen. Zwar gibt es bereits Plattformen für das Störungsscreening in Plattenform für die Transkriptomik in großen Mengen9,10 und Einzelzellen11,12, diese erfordern jedoch in der Regel eine große Anzahl von Zellen pro getesteter Bedingung und wurden nicht für das Screening von Arzneimittelkombinationen verwendet. Daher wird die Integration transkriptomischer Auslesungen in eine miniaturisierte kombinatorische Arzneimittel-Screening-Plattform mit der Möglichkeit zum Screening von Tumorbiopsien relevantere Vorhersagen ermöglichen und unser Verständnis der Wirkungsweise synergistischer und antagonistischer Arzneimittel-Arzneimittel-Wechselwirkungen verbessern.

Tröpfchenbasierte Mikrofluidik, die Tröpfchen in Pikoliter- bis Nanolitergröße als Reaktionsgefäße zur Durchführung zellulärer Screenings verwendet, bietet einen vielversprechenden Ansatz zur Erreichung dieses Ziels. Aufgrund der Miniaturisierung um mehrere Größenordnungen im Vergleich zu herkömmlichen plattenbasierten Screens kann die Anzahl der Medikamente oder Medikamentenkombinationen massiv erhöht werden, während mit geringen Eingangszellzahlen gearbeitet wird13. Wir haben zuvor den ersten Schritt in diese Richtung demonstriert, indem wir Braille-Ventile in ein Tröpfchen-Mikrofluidiksystem integriert haben, um Arzneimittelkombinationen in sogenannten Plugs (~500 nl große Tröpfchen) zu erzeugen, die nacheinander in Schläuchen gespeichert sind14. Plugs wurden verwendet, um 56 kombinatorische Behandlungsoptionen direkt an Pankreastumorbiopsien zu testen und mithilfe einer phänotypischen Apoptose-Auslesung die wirksamsten Arzneimittelpaare zu finden. Während unser bisheriger Ansatz den ersten Proof of Concept beim direkten Screening von Patientenmaterial lieferte, begrenzten die immer noch relativ großen Volumina von 500 nl die Anzahl der getesteten Arzneimittelpaare. Darüber hinaus liefert ein Apoptose-Assay nur eine einzige Endpunktanzeige mit begrenzten Einblicken in die Wirkungsweise der Arzneimittelpaare, was unser Verständnis und die Vorhersagbarkeit von Arzneimittelkombinationen zur Bekämpfung von Resistenzmechanismen erheblich verbessern könnte.

Um diese Einschränkungen zu überwinden, präsentieren wir hier eine mikrofluidische Plattform, die die Durchführung hochmultiplexer Screens von Hunderten von Arzneimittelkombinationen in einer Emulsion aus Tröpfchen in Pikolitergröße ermöglicht. Durch die Einführung eines deterministischen kombinatorischen Barcode-Ansatzes, bei dem Sätze aus zwei Barcodes Arzneimittelpaare codieren, ist es uns gelungen, alle Bedingungen auf hochmultiplexte Weise zu überprüfen, ohne dass eine räumliche Reihenfolge eingehalten werden muss (z. B. Wells, Plug-Sequenz). Da die DNA-Barcodes für die Analyse des gesamten Transkriptoms von Zellen nach Medikamenteneinnahme konzipiert wurden, konnten wir zusätzlich eine massiv parallelisierte, auf der Genexpression basierende Profilierung von Medikamentenkombinationen durchführen. Wir haben gezeigt, dass der vorgestellte Combi-Seq-Ansatz zur Bestimmung des Einflusses von Arzneimitteln auf die Lebensfähigkeit der Zellen und die zelluläre Signalübertragung eingesetzt werden kann und somit einen Hochdurchsatzansatz zur Entdeckung synergistischer Arzneimittelpaare und zur Entschlüsselung ihrer Wirkungsweise bietet.

Multiplex-kombinatorische Arzneimittelscreenings wurden in Einzelzelltröpfchen durchgeführt, indem Arzneimittel zusammen mit DNA-Barcodefragmenten eingekapselt wurden (Abb. 1a). Jede paarweise Arzneimittelkombination wurde durch eine einzigartige Kombination aus zwei DNA-Barcode-Fragmenten kodiert, die zusammen eine Priming-Stelle für die reverse Transkription (Poly-dT) und PCR bereitstellten. Nach der Off-Chip-Inkubation der Tröpfchen wurden jedem Tröpfchen durch Picoinjektion Reagenzien für die Zelllyse, die Barcode-Fragment-Ligation und die reverse Transkription hinzugefügt15. Die Ligation zweier Barcode-Fragmente (BC-RT und BC-PCR) führte zu funktionellen Barcodes, die paarweise Arzneimittelkombinationen kodierten (Abb. 1). Da die Barcodes für die reverse Transkription von aus lysierten Zellen freigesetzter mRNA verwendet wurden, wurden die Transkriptome entsprechend der medikamentösen Behandlung mit Barcodes versehen (Abb. 1b). Anschließend wurde barcodierte cDNA aus den Tröpfchen extrahiert, um eine Sequenzierungsbibliothek zu erstellen (ergänzende Abbildung 1). Abschließend wurde eine Sequenzierung durchgeführt, um die Behandlungsbedingungen zu demultiplexen und ihre Auswirkungen auf die Genexpression zu analysieren.

a Überblick über den Combi-Seq-Workflow: (1) Zellen wurden mit Medikamentenkombinationen und Paaren von Barcode-Fragmenten, die Medikamente kodieren, eingekapselt. (2) Nach der Inkubation außerhalb des Chips wurden die Tröpfchen für die Pikoinjektion erneut in einen Chip injiziert, um Reagenzien für die Barcode-Ligation und die Reverse Transkription (RT) hinzuzufügen, wodurch die Barcode-Kennzeichnung des Transkriptoms entsprechend der Arzneimittelbehandlung ermöglicht wurde. (3) Beim Aufbrechen der Tröpfchen wurden gepoolte Bibliotheken für die Sequenzierung generiert, in denen Zellen aus derselben Behandlungsgruppe denselben Barcode aufweisen. Dies erleichterte die Demultiplexierung medikamentöser Behandlungen und auf der Genexpression basierender Auslesungen für Pools von 250 Zellen. b Barcode-Strategie zur Kodierung und Dekodierung von Medikamentenkombinationen für Zellpools mit geringem Input. Paare aus barcodierten PCR-Primern (BC-PCR) und barcodierten Poly-dT-Primern (BC-RT) wurden in einer Ligationsreaktion zu funktionellen Barcodes zusammengefügt, die für die reverse Transkription verwendet wurden und so eine Kombination aus zwei Arzneimitteln kodierten. Durch das Aufbrechen von Tröpfchen kann barcodierte cDNA gewonnen und für die Sequenzierung amplifiziert werden. c Mikrofluidische Pipeline zur Erzeugung von Medikamentenkombinationen in Tröpfchen. (1) Braille-Ventile wurden verwendet, um Sequenzen von 20 Medikamenten-Barcode-Steckern (BC-RT) innerhalb des Verzögerungsschlauchs zu erzeugen. Der Verzögerungsschlauch war mit einem Tropfenmacher (2) verbunden, in den Zellen und Arzneimittel-BC-PCR-Gemische aus Multiwell-Platten injiziert wurden. Schließlich wurden durch das Einspritzen der Pfropfen in den Tropfenmacher durch Öffnen zweier Ölventile Tröpfchen erzeugt, die Arzneimittelpaare mit Barcodes und Zellen enthielten. M1–M3 geben Positionen an, an denen Fluoreszenzsignale erfasst wurden. d Erzeugung von Medikamenten-Barcode-Steckern im Verzögerungsschlauch: (1) Durch Öl beabstandete Stecker wurden durch sequenzielles Öffnen der entsprechenden Ventile erzeugt, (2) was zu einer Folge von 20 Medikamenten-Barcode-Steckern führte. (3) Durch Öffnen zweier Ölventile wurden die Stopfen im Verzögerungsschlauch in den Tröpfchenerzeugerchip eingespritzt. e Tröpfchenproduktion aus einer Zellsuspension, Medikamenten-Barcode-Pfropfen und Medikamenten-Barcode-Mischungen, die vom Autosampler injiziert werden, was zur Co-Einkapselung von Zellen mit Medikamenten-Barcode-Kombinationen führt. f Schema zur Darstellung der Generierung von Arzneimittelkombinationen aus 20 Arzneimitteln aus dem Ventilmodul mit Arzneimitteln aus einer 96-Well-Platte. Jede Sequenz von 20 Medikamenten-Barcode-Pfropfen (BC-RT) wurde mit Medikamenten-Barcode-Mischungen (BC-PCR) aus einer Vertiefung kombiniert.

Um Arzneimittelkombinationen in Tröpfchen in Pikolitergröße zu erzeugen, haben wir das Braille-Ventilsystem und die Injektion von Arzneimitteln auf Autosampler-Basis in einen Tröpfchenhersteller-Chip synchronisiert (Abb. 1c). Darüber hinaus wurden Zellsuspensionen mit einer Dichte von 0,1 Zellen pro Tröpfchenvolumen in den Tröpfchenmacherchip injiziert, um Tröpfchen mit einzelnen Zellen zu erhalten (Zusatzfilm 1). Der Autosampler (Dionex) war mit einer Platte mit 96 Vertiefungen beladen, wobei jede Vertiefung ein einzelnes Medikament zusammen mit dem entsprechenden Barcode-Primerfragment (BC-PCR) und einem Markerfarbstoff enthielt, der die Überwachung späterer Mischschritte ermöglichte. Die Medikamente wurden nacheinander abgesaugt und in den Tröpfchenmacher injiziert. Das Zeitfenster zwischen zwei Proben aus dem Autosampler (~3 Minuten) wurde genutzt, um durch Injektion eine Sequenz von 20 chemisch unterschiedlichen Plugs zu erzeugen, die jeweils einzigartige Paare aus zwei Medikamenten und zwei Barcode-Fragmenten (BC-RT und BC-PCR) enthielten Sekundärmedikamente und Barcodes (BC-RT) in einen separaten Braille-Ventilchip (Abb. 1c und ergänzende Abb. 2a). Insbesondere wurde jedes Verbundventil nacheinander geöffnet und dazwischen fluoriertes Öl injiziert, sodass durch eine nicht mischbare Ölphase beabstandete Arzneimittel-Barcode-Pfropfen in einen Verzögerungsschlauch injiziert werden konnten (Abb. 1d). Sobald der Verzögerungsschlauch mit einer Folge von 20 Stopfen gefüllt war, wurden zwei Ölventile geöffnet, um alle Stopfen in den Tröpfchenerzeuger einzuspritzen (~ 2 Minuten, ergänzende Abbildung 2b).

Dabei wurden Medikamenten-Barcode-Stecker aus dem Ventilsystem mit den aus dem Autosampler injizierten Medikamenten-Barcode-Mischungen kombiniert und zusammen mit einzelnen Zellen in Tröpfchen verkapselt (Abb. 1e). Durch die Wiederholung dieses Vorgangs wurden Hunderte von Kombinationen mit bestimmten Paaren von Barcodefragmenten generiert (Abb. 1f). Es ist wichtig zu beachten, dass die Anzahl der Kombinationen durch eine Erhöhung der Anzahl der vom Autosampler injizierten Arzneimittel erhöht werden kann.

Die Synchronisierung zwischen dem Autosampler und der ventilbasierten Medikamenteninjektion war entscheidend, um sicherzustellen, dass Kombinationen erst dann erzeugt wurden, wenn das vom Autosampler injizierte Medikament seine Plateaukonzentration erreicht hatte. Zwischen jedem aus dem Autosampler kommenden Medikament wurde ein Zeitfenster mit abnehmenden und steigenden Konzentrationen beobachtet, wie durch die abwechselnde Injektion von Fluoreszenzfarbstoffen gezeigt (Abb. 2a). Dieses Phänomen basiert auf der Taylor-Aris-Dispersion gelöster Stoffe in der kontinuierlichen, mischbaren Trägerphase (PBS) des Autosamplers16. Während dieses Zeitfensters wurden keine Kombinationen erzeugt, sondern vielmehr zur Herstellung von Verbundstopfen im Verzögerungsrohr des Braille-Moduls verwendet . Sobald die Plateaukonzentration erreicht war, was durch die Messung einer konstanten Intensität eines fluoreszierenden Markerfarbstoffs angezeigt wurde, wurden die 20 Verbindungspfropfen in den Tröpfchenmacher injiziert und mit dem Medikament aus dem Autosampler und den Zellen zu Tröpfchen kombiniert. Die Injektion einer solchen Pfropfenreihe dauerte 2 Minuten, was zu einer Gesamtzeit (Pfropfenproduktion und Injektion) von 15 Sekunden für die Erzeugung von etwa 2500 zellenhaltigen Tröpfchen und einer mit einem Barcode versehenen kombinatorischen Behandlungsbedingung führte. Sobald alle 20 Plugs injiziert waren, begann der Autosampler mit der Aufnahme des nachfolgenden Medikaments.

a Abwechselnde Injektion von Alexa-488 oder Cascade-Blue aus einer 96-Well-Platte unter Verwendung des Autosamplers. Proben, die im Zeitfenster abnehmender und zunehmender Fluoreszenzsignale (grauer Kasten) injiziert wurden, wurden verworfen, indem sichergestellt wurde, dass keine Kombinationen erzeugt wurden. Da in Zeitfenstern mit instabilen Konzentrationen (grauer Kasten) keine Medikamenten-Barcode-Plugs aus der Braillezeile injiziert wurden, enthielten die Tröpfchen nur nicht funktionsfähige Barcodes (BC-PCR). Zeitfenster mit stabilen Fluoreszenzsignalen (blauer Kasten) wurden genutzt, um Medikamentenkombinationen durch Co-Injektion von 20 auf dem Braille-Display-Chip erzeugten Plugs zu generieren, was zu funktionsfähigen Barcodes führte. b Fluoreszenzintensitäten einer Plug-Sequenz aus den Braille-Ventilen, ergänzt mit Alexa-488 oder Cascade-Blue, gemessen an Position M1 (= vor dem kombinatorischen Mischen). Die blaue Überlagerung, die (a) und (b) verbindet, veranschaulicht eine Zeitreihe, in der ein Zyklus von 20 Plugs (zweiter Plug ohne Referenzfarbstoff) mit einer Probe aus dem Autosampler kombiniert wird. Abwechselnde Sequenzen von Medikamenten, ergänzt mit Cascade-Blue oder Alexa-488, wurden verwendet, um die Kreuzkontamination zwischen spezifischen (z. B. grünen) fluoreszierenden positiven Pfropfen in der nachfolgenden negativen (z. B. blauen) Probe für beide Injektionsmodi getrennt zu quantifizieren. c Kreuzkontamination von grünen Plussteckern zu grünen Minussteckern der Braillezeile (11 Zyklen, wie in b gezeigt). d Kreuzkontaminationen von Steckern für drei verschiedene Chips: Das Verhältnis zwischen den Fluoreszenzintensitäten eines blauen oder grünen negativen Steckers und des vorherigen blauen oder grünen positiven Steckers wurde analysiert, um den Grad der Kreuzkontamination zwischen aufeinanderfolgenden Proben zu quantifizieren (n = 99, n = 80 bzw. n = 171). e Fluoreszenzsignale von Tröpfchen, die kombinatorische Mischungen enthalten. Streudiagramm, das die Fluoreszenzintensitäten darstellt, die für Tröpfchen gemessen wurden, die nur von mit Cascade-Blue markierten Stopfen erzeugt wurden, und nur von Alexa-488, das vom Autosampler injiziert wurde, gemessen am Tröpfchenauslass (n = 91.899). f Fluoreszenzsignale von Tröpfchen aus (e) dargestellt für 180 Einzelkombinationen. Die Farben stellen Zyklen von 20 Medikamentensteckern in Kombination mit einem Medikament aus dem Autosampler dar. Die Boxplots zeigen den Median sowie das erste und dritte Quartil als Box, und die Whiskers zeigen die extremsten Datenpunkte innerhalb von 1,5 Längen der Box an. M1–M3 geben die Positionen an, wie in Abb. 1c gezeigt. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Um den Tröpfcheninhalt mit geringfügiger Kreuzkontamination sicherzustellen, haben wir die Geometrie und die Verzögerungsschlauchanschlüsse der Braille-Ventil-Tropfenmacherchips so gestaltet, dass keine restlichen Arzneimittel-Barcode-Mischungen in den Kanälen zurückbleiben (ergänzende Abbildung 3). Vor jedem Experiment haben wir einen Proxy für den Grad der Kontamination zwischen den Steckern der Braillezeile gemessen. Dies geschah durch die Verwendung von Medikamenten, die abwechselnd mit Alexa-488 oder Cascade-Blue ergänzt wurden, was zu einer abwechselnden Abfolge von blauen und grünen Fluoreszenzpeaks führte (Abb. 2b). Die Fluoreszenzintensitäten der Plugs wurden am Tröpfchenmacher gemessen und Verunreinigungen von Arzneimitteln/Farbstoffen von einem Plug in den nachfolgenden Plug wurden entweder durch grüne Signale in UV-Peaks oder UV-Signale in grünen Peaks erkannt (Abb. 2c).

Das Verhältnis zwischen den Fluoreszenzsignalen jedes negativen Peaks (n) im grünen oder UV-Kanal und dem vorherigen positiven Peak (n-1) wurde als Proxy zur Quantifizierung des Ausmaßes der Kreuzkontaminationen zwischen zwei Arzneimitteln verwendet (Abb. 2d). ). Bei drei verschiedenen Chip-Setups (Braille-Ventil und Drop-Maker) fanden wir einen Mittelwert von 1,5 % der Kontamination im UV-Kanal und 0,7 % im grünen Kanal (Ergänzungstabelle 1), was darauf hindeutet, dass die beschriebenen Systeme zur Generierung angewendet werden können Kombinationen mit ausreichend hoher Reinheit.

In der beschriebenen Mikrofluidik-Pipeline wurden Medikamentenkombinationen durch Mischen von Medikamenten erzeugt, die von einem Autosampler und einem Braille-Ventilmodul injiziert wurden. Um präzise und genaue Wirkstoffkonzentrationen in Tröpfchen zu gewährleisten, mussten beide Wirkstoffe in einem konstanten und vordefinierten Verhältnis eingekapselt werden. Wir haben das präzise Mischen zweier Medikamente validiert, indem wir alle Verbindungen auf der Braillezeile mit Cascade-Blue und alle Verbindungen aus dem Autosampler mit Alexa-488 ergänzt haben. Wir beobachteten eine sehr dichte Hauptpopulation doppelt blauer und grüner doppelt positiver Tröpfchen, was zeigt, dass beide Verbindungen in einem konstanten Verhältnis gemeinsam eingekapselt waren (Abb. 2e). Darüber hinaus haben wir die stabile Co-Einkapselung der beiden Farbstoffe für Tröpfchen über einzelne Kombinationen hinweg bestätigt (Abb. 2f). Die mittleren Fluoreszenzintensitäten einzelner Kombinationen waren äußerst stabil mit Variationskoeffizienten (CV) über 180 Kombinationen von 2,9 bzw. 3 % für die blaue bzw. grüne Intensität. Die Streuung der Tröpfchen um die Hauptpopulation kann durch eine kurze (<100 ms) Strömungsgleichgewichtsphase am Anfang und Ende der Pfropfen und Schwankungen der Tröpfchenbahn innerhalb eines fokussierten Laserstrahls erklärt werden (Ergänzungsabbildung 4 und Ergänzungsfilm 2). . Wir kamen daher zu dem Schluss, dass die Injektionsmodi (Braille-Ventil oder Autosampler) robust synchronisiert werden können, um Arzneimittelkombinationen in Tröpfchen mit hoher Präzision und Reinheit zu erzeugen.

Um die Mikrofluidik-Pipeline zu charakterisieren und ihre Anwendbarkeit zur Durchführung kombinatorischer Arzneimittelscreenings auf Basis der Genexpression zu demonstrieren, haben wir ein kleines 4 × 4-Arzneimittelscreening entwickelt (Tabelle 1). Zunächst wollten wir beurteilen, ob der Injektionsmodus der Medikamente über die Braille-Ventile im Vergleich zum Autosampler zu einer Verzerrung führt, und haben daher den gleichen Medikamentensatz auf die Braille-Ventile und den Autosampler geladen. Im Falle einer Injektionsverzerrung würden wir erwarten, dass Unterschiede zwischen derselben Kombination in umgekehrter Reihenfolge auftreten (z. B. Imatinib und Trametinib vs. Trametinib und Imatinib). Zweitens wollten wir den Einfluss des Barcode-Modus auf die Genexpressionsanzeige bewerten. Zu diesem Zweck haben wir zunächst die Behandlungsbedingungen so kodiert, dass die über die Braille-Ventile injizierten Medikamente mit BC-RT mit Barcode ergänzt wurden, während Medikamente aus dem Autosampler mit BC-PCR ergänzt wurden. Dann wiederholten wir das Experiment mit BC-RT-kodierenden Medikamenten aus dem Autosampler und BC-PCR-kodierenden Medikamenten aus den Braille-Ventilen und erwarteten vergleichbare Ergebnisse, wenn der Barcode-Modus die Messwerte nicht beeinflusst. Wir nutzten die beschriebene Pipeline, um Tröpfchen zu erzeugen, die jeweils einzelne menschliche Leukämie-K562-Zellen und alle paarweisen Kombinationen von Medikamenten und die entsprechenden Barcodes enthielten, und inkubierten die Emulsion 12 Stunden lang. Nach der Ligation bildeten die beiden Barcode-Primerfragmente einen funktionellen Barcode, der die paarweise Arzneimittelkombination kodierte. Um drei Replikate zu erhalten, wurde der gesamte Prozess dreimal durchgeführt.

Jeder ligierte Barcode wurde verwendet, um die Transkriptome aus gestörten Zellen rückwärts zu transkribieren (Abb. 1a). Nach der Datenvorverarbeitung (Methoden zur Genexpressionsdaten-Vorverarbeitung) und ersten Qualitätskontrollen (mittlerer Lesewert und Genzahl pro Probe von 3,47 × 105 bzw. 3229, ergänzende Abbildung 5) führten wir eine Dimensionsreduktion mithilfe der t-verteilten stochastischen Nachbareinbettung (t) durch -SNE, Abb. 3a) auf der demultiplexten Zählmatrix. Um zu analysieren, ob aufgrund der Injektionsquelle (Autosampler oder Braille-Ventile) eine systematische Verzerrung auftritt, haben wir die Proben nach dem Medikament des Autosamplers (Abb. 3a, oberes linkes Feld) und dem Medikament der Braille-Ventile (Abb. 3a, oberes rechtes Feld) analysiert. , die „geordnete“ Arzneimittelkombination (bei der wir z. B. zwischen Imatinib-Trametinib und Trametinib-Imatinib-Kombination unterschieden haben) und die „ungeordnete“ Arzneimittelkombination (bei der nicht zwischen Imatinib-Trametinib- und Trametinib-Imatinib-Proben unterschieden wurde). Während der Injektionsmodus für einzelne Medikamente aus dem Autosampler (Abb. 3a, oberes linkes Feld) oder den Braille-Ventilen (Abb. 3a, oberes rechtes Feld) nur einen mäßigen Einfluss auf die Clusterung einzelner Datenpunkte hat, sind deren paarweise Kombinationen (Abb . 3a, Bodenplatten) ist der stärkere Faktor für den Zusammenhalt und die Trennung zwischen den Proben.

a TSNE-Diagramme normalisierter Genexpressionsdaten. Die Proben sind farblich gekennzeichnet, basierend auf dem Autosampler-Medikament (oberes linkes Feld), dem Braille-Ventil-Medikament (oben rechts), einer geordneten Kombination (unten links) und einer ungeordneten Kombination (unten rechts). Der Farbcode ist für Autosampler- und Braille-Ventile-Medikamente (obere Tafeln) gekennzeichnet. b Silhouette-Scores der Probenclusterung basierend auf Autosampler-/Braille-Ventil-Medikamenten und geordneten/ungeordneten Kombinationen. Die Silhouetten-Scores werden mit Zufallsverteilungen (Farbcode) verglichen, die durch Permutation von Probenbeschriftungen erstellt wurden. c Pathway-Aktivitäts-Heatmap von Proben. Für jede Probe wurden die PROGENy-Pathway-Aktivitäten berechnet (Z-Scores der Pathway-Aktivitäten, Farbcode) und die Pathway-Aktivitätsmatrix wurde hierarchisch gruppiert. Medikamente in Kombinationen sind farblich gekennzeichnet (hellgrün: Medikament des Autosamplers, blau: Medikament der Braille-Ventile, Cyan: Gleiches Medikament des Autosamplers und der Braille-Ventile). d Arzneimittelinduzierte Veränderungen der Signalwegaktivität. Für jeden Signalweg wurde ein lineares Modell (pathway_activity ~YM155 + Imatinib + Trametinib) angepasst, und die linearen Modellkoeffizienten (Farbcode) für jedes Medikament werden als Heatmap dargestellt. e Arzneimittelinduzierte MAPK-Aktivitätsänderungen. MAPK-Aktivität (y-Achse), gruppiert nach Autosampler-Medikament (x-Achse) und Braille-Ventil-Medikament (Farbcode), n = 3 biologisch unabhängige Experimente für alle Proben, außer YM155_Imatinib und DMSO_Imatinib n = 2. Die Boxplots zeigen den Median und erstes und drittes Quartil als Box, und die Whiskers geben die extremsten Datenpunkte innerhalb von 1,5 Längen der Box an. f Korrelation der MAPK-Pathway-Aktivitäten zwischen zwei 4 × 4-Bildschirmen, durchgeführt mit vertauschten Barcode-Zuordnungen (r = 0,637, p = 0,01 und R2 = 0,406), der schattierte Bereich zeigt ein 95 %-Konfidenzintervall der Regressionsschätzung. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Um das Ausmaß der Probenclusterung basierend auf der Injektionsquelle für geordnete und ungeordnete Kombinationen weiter zu quantifizieren, führten wir eine Silhouettenanalyse durch (Abb. 3b und Methoden-Clustering-basierte Qualitätskontrolle von Genexpressionsdaten). Da die Verteilung der Silhouette-Scores von der Anzahl der Cluster abhängt (4 für Arzneimittel, 16 für ungeordnete und 10 für geordnete Kombinationen), haben wir die Silhouette-Scores der Clusterbildung mit Zufallsverteilungen verglichen, die durch Permutation der Probenbezeichnungen erstellt wurden. Die Silhouettenwerte für einzelne Medikamente und Kombinationen waren signifikant höher (p-Werte <0,01) als die Hintergrundverteilungen, was zeigt, dass sich die Proben auf der Grundlage der verwendeten Medikamente und Kombinationen gruppieren. Folglich führen auch der Barcode-Modus für einzelne Medikamente, die über die Braille-Ventile injiziert werden, oder der Autosampler, der entweder mit Barcode-RT- oder PCR-Primern codiert ist, nicht zu einer Verzerrung, da ihre Auswirkungen auf die Clusterbildung und damit die Genexpression nicht zu unterscheiden sind. Im Gegensatz dazu wurden paarweise Kombinationen durch die Gruppierung der Proben bestimmt, was zeigt, dass beide Drogen zusammen auf unvoreingenommene Weise nachgewiesen wurden. Wir führten auch eine hierarchische Clusterbildung unter Verwendung der 100 am stärksten exprimierten Gene in allen Proben durch, was auch eine arzneimittel- und kombinationsbasierte Clusterbildung der Proben zeigte (ergänzende Abbildung 6). Darüber hinaus wurden behandelte Proben in einer Hauptkomponentenanalyse (PCA, ergänzende Abbildung 7) im Allgemeinen gut von DMSO-Kontrollen getrennt. Um weiter zu zeigen, dass unsere experimentelle Pipeline keine wesentlichen technischen Verzerrungen mit sich bringt, haben wir das kleine 4 × 4-Screening mit vertauschten Barcodes durchgeführt (Braille-Ventil-Medikamente ergänzt durch BC-PCR und Autosampler-Medikamente ergänzt durch BC-RT). Wir beobachteten eine ähnliche Qualität (ergänzende Abbildung 8) und Clusterbildung von Proben basierend auf tSNE und den 100 am häufigsten exprimierten Genen (ergänzende Abbildungen 9a, b, 10).

Um die Genexpressionssignaturen von Zellen, die mit verschiedenen Kombinationen behandelt wurden, weiter zu analysieren, berechneten wir mithilfe der PROGENy-Methode Änderungen der Signalwegaktivität für jede Probe17,18,19. PROGENy berechnet Signalwegaktivitäten aus Genexpressionsdaten für 14 krebsbezogene Signalwege. Die hierarchische Gruppierung von Proben basierend auf Signalwegaktivitäten (Abb. 3c) zeigte auch die auf Medikamenten und Kombinationen basierende Gruppierung. Wir beobachteten zwei Hauptcluster, von denen einer Kombinationen einschließlich YM155 entsprach, während der andere von mit Trametinib behandelten Proben dominiert wurde. Bei der Analyse der Zusammenhänge zwischen Aktivitätsänderungen der Signalwege und Arzneimitteln (Abb. 3d) stellten wir eine verringerte Aktivität des Hypoxie-Signalwegs in allen mit YM155 behandelten Proben fest, während alle mit Trametinib (MAPK-Inhibitor) behandelten Proben eine starke Inaktivierung von MAPK zeigten (Abb. 3e, S Wert aus einem linearen Modell: 0,03) und verwandte EGFR-Pfade. Darüber hinaus fanden wir bei der Korrelation der MAPK-Pathway-Aktivitätswerte aus dem kleinen 4 × 4-Bildschirm (Abb. 3e) und dem ausgetauschten 4 × 4-Bildschirm (ergänzende Abb. 9e) eine signifikante Korrelation (r = 0, 637, p = 0, 01). Demonstration der reproduzierbaren Erkennung von Signalwegaktivitäten (Abb. 3f). Die Pathway-Analyse legt nahe, dass die beobachteten Genexpressionsänderungen dem bekannten Wirkmechanismus der verwendeten Medikamente entsprechen, den wir in der folgenden Diskussion näher erläutern. Zusammenfassend unterstützen die Ergebnisse den Einsatz unserer Screening-Methode zur Analyse kombinationsinduzierter Genexpressionsänderungen im Hochdurchsatzverfahren, wodurch die Charakterisierung von Arzneimittelreaktionen im Vergleich zu zuvor verwendeten phänotypischen Tests viel detaillierter möglich wird14.

Um die Robustheit der Combi-Seq-Pipeline zu bewerten, verglichen wir die Pathway-Aktivitäten aus dem 4 × 4 Combi-Seq-Arzneimittelscreening in Tröpfchen mit den Aktivitäten aus demselben Screen, der in einer Multiwell-Platte durchgeführt wurde (mittlere Lesezahl 1,07 × 106). Die hierarchische Gruppierung von Korrelationen zwischen Pfadaktivitäten aus Massendaten (ergänzende Abbildung 11) und Tröpfchendaten (Abb. 3c) führte zu zwei Hauptclustern, die durch positive Korrelationen in den Pfadaktivitäten bedingt waren: Für beide Formate wurde ein Cluster durch positive Korrelationen zwischen behandelten YM155-Daten gebildet Zellen und der andere Cluster wurden durch positive Korrelationen der Imatinib-Behandlungen angetrieben (Abb. 4a). Daher konnten wir zeigen, dass tröpfchenbasierte Arzneimittelscreenings mit geringem Input und flacher Sequenzierung als Auslesung die Hauptmerkmale von Massendaten mit tiefer Sequenzierung und hohem Input auf der funktionalen Ebene der Signalwegaktivitäten erfassen. Darüber hinaus verglichen wir die Combi-Seq-Barcoding-Strategie mit der herkömmlichen PolyA-basierten mRNA-Erfassung (PolyA) im Massenformat. Die Genexpression zwischen Combi-Seq- und PolyA-Daten zeigte Korrelationskoeffizienten zwischen 0,576 und 0,646 (ergänzende Abbildung 12), vergleichbar mit den Ergebnissen früherer Vergleiche verschiedener RNA-Seq-Sequenzierungsansätze (z. B. Prime-Seq vs. True-Seq: R2 =). 0,64)20, was darauf hindeutet, dass der Combi-Seq-Ansatz keine größeren Verzerrungen während der Bibliotheksvorbereitungsschritte mit sich bringt.

Eine Heatmap der Korrelationen zwischen Signalwegaktivitäten von Bulk- und Tröpfchen-Combi-Seq-Daten: Die PROGENy-Signalwegaktivitäten wurden für jede Probe bestimmt und Korrelationen für übereinstimmende Proben unter Verwendung von entweder in Mikrotiterplatten (Zeilen) oder Tröpfchen (Spalten) erhaltenen Daten berechnet (Farbcode blau). zu rot) und wird zur hierarchischen Clusterbildung verwendet. Medikamente in Kombinationen sind farblich gekennzeichnet (hellgrün: Medikament aus Autosampler, blau: Medikament aus Braille-Ventilen, Cyan: Gleiches Medikament aus Autosampler und Braille-Ventilen). b Genauigkeit der Spike-in-Erkennung als Korrelation zwischen der ERCC-Eingabekonzentration und den gemessenen Transkripten pro Million (TPM) für 250 Zellen pro Probe, der schattierte Bereich zeigt das 95 %-Konfidenzintervall der Regressionsschätzung. (c) Zusammenfassung der Korrelationskoeffizienten für 125 (R = 0,63 und R2 = 0,40), 250 (R = 0,65 und R2 = 0,42) und 500 Zellen (R = 0,7 und R2 = 0,49) pro Probe, n = 5 biologisch unabhängige Experimente Die Daten werden als Mittelwerte ± 95 % Konfidenzintervall dargestellt. d Sensitivität als Nachweiswahrscheinlichkeit für Spike-in-Moleküle für 250 Zellen pro Probe. Ein Spike-In galt als erkannt, wenn die Wahrscheinlichkeit 50 % erreichte. e Zusammenfassung der Empfindlichkeiten für unterschiedliche Mengen (125, 250 und 500) Zellen pro Probe, n = 5 biologisch unabhängige Experimente, Daten wurden als Mittelwerte ± 95 % Konfidenzintervall dargestellt. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Um die Empfindlichkeit und Genauigkeit des Combi-Seq-Ansatzes zu testen, haben wir außerdem eine Bibliothek mit 92 verschiedenen DNA-Sequenzen des External RNA Controls Consortium (ERCC) genutzt. Wir haben ERCC-Moleküle in Tröpfchen versetzt und die Genauigkeit (Abb. 4b, Korrelation zwischen ERCC-Molekülkonzentration und gemessener Expression) und Empfindlichkeit (Abb. 4d, Schwelle für den ERCC-Molekülnachweis) analysiert. Wir beobachteten eine zunehmende Genauigkeit (Abb. 4c, 0,63, 0,65, 0,7 Pearson-Korrelation für 125, 250 bzw. 500 Eingabezellen) und Empfindlichkeit (Abb. 4e, 2,55, 2,06 und 1,48 log10 (Attomol/ul) Nachweisgrenze für 125, 250 bzw. 500 Eingabezellen) der Combi-Seq-Methode mit erhöhtem Eingabematerial (Anzahl der Zellen pro Tröpfchen, wobei die Menge der hinzugefügten ERCC-Spike-Ins proportional zur Anzahl der Zellen erhöht wurde). Diese Ergebnisse liegen im Bereich anderer RNA-Seq-Ansätze mit geringem Aufwand21.

Basierend auf den vielversprechenden Ergebnissen des 4×4-Arzneimittelkombinationsexperiments führten wir ein Hochdurchsatz-Screening durch, bei dem insgesamt 420 verschiedene kombinatorische Behandlungsbedingungen zum Einsatz kamen. Für diese Studie haben wir bewusst Medikamente mit niedrigen logD-Werten ausgewählt (Ergänzende Abbildung 13 und ergänzende Daten). Auf diese Weise kann der unerwünschte Austausch typischerweise hydrophober Verbindungen minimiert werden22. Darüber hinaus haben wir eine Reihe systematischer Experimente durchgeführt, um zu testen, ob der Drogenaustausch unsere Ergebnisse beeinflusst. Insbesondere haben wir Tröpfchen, die nur ein Medikament und Zellen enthielten (behandelt), mit Tröpfchen gemischt, die nur DMSO und Zellen enthielten (DMSO-Kontrollen), und sie 24 Stunden lang bei 37 ° C inkubiert (ergänzende Abbildung 14a). Zusätzlich wurden Tröpfchen mit DMSO und Zellen separat als Positivkontrolle für einen unbehandelten Phänotyp inkubiert und verarbeitet (separate DMSO-Kontrollen). Anschließend wurden die Zellen lysiert und Barcodes ligiert, um eine reverse Transkription für die Sequenzierung des gesamten Transkriptoms durchzuführen (ergänzende Abbildung 14b). Projektionen der Daten unter Verwendung von UMAP trennten die behandelten Proben von den DMSO-Kontrollproben, wobei sich die meisten DMSO-Kontrollproben zusammenballten (ergänzende Abbildung 14c). Dies weist darauf hin, dass über eine Inkubationszeit von 24 Stunden die Wirkung von Arzneimitteln nur bei Tröpfchen beobachtet werden kann, die das Arzneimittel überhaupt enthielten, nicht jedoch bei Tröpfchen, die nur DMSO enthielten. Überzeugenderweise zeigten die unbehandelten DMSO-Proben, die mit medikamentenhaltigen Tröpfchen inkubiert wurden, eine gute Clusterbildung mit den DMSO-Kontrollen, die separat gehandhabt wurden, selbst bei Arzneimitteln mit positiven LogD-Werten wie Imatinib. Um optimale Arzneimittelkonzentrationen für groß angelegte kombinatorische Screens abzuschätzen, haben wir Dosis-Wirkungs-Kurven mit K562-Zellen erstellt, um deren 35 % Wachstumshemmungswerte (GR) für jedes einzelne Arzneimittel zu bestimmen. Im Vergleich zur herkömmlichen Metrik, dem IC50-Wert, ist der GR50 (oder in unserem Fall der GR35) nicht empfindlich gegenüber der Anzahl der Teilungen, die während der Arzneimittelbehandlungen auftreten, die je nach Zelllinie und Zustand variieren können (ergänzende Daten). 23. Die Medikamente wurden den Braille-Ventilen oder dem Autosampler zugewiesen, um eine ausgewogene Verteilung der Medikamente mit hohen und niedrigen GR35-Werten zu erreichen. Auf die Braille-Ventile oder den Autosampler geladene Medikamente wurden mit BC-RT bzw. BC-PCR ergänzt. Unser Ziel war es, für jede der 420 Behandlungsbedingungen 250 Tröpfchen zu erzeugen, die eine einzelne Zelle enthielten, und die Tröpfchen 12 Stunden lang bei 37 °C zu inkubieren, bevor wir eine Pikoinjektion für Zelllyse, Barcode-Ligationen und RT durchführten (Abb. 1a). Dieser Vorgang wurde dreimal durchgeführt, um Replikate zu erhalten.

Nach anfänglicher Vorverarbeitung und Qualitätskontrolle (mittlere Messwerte und Gene pro Probe von 32892 bzw. 547, ergänzende Abbildung 15) führten wir die gleiche Dimensionsreduktion (Abb. 5a) und Silhouettenanalyse (Abb. 5b) wie für 4 durch × 4 Bildschirm. Auch hier gruppierten sich die Proben basierend auf der verwendeten Kombination deutlich besser als zufällig erwartet (p-Werte der Silhouette-Scores vs. Zufallsverteilung: <0,01, 0,47 und <0,01 für Autosampler-Medikament, Braille-Ventil-Medikament bzw. Kombination). Wir fanden auch heraus, dass die niedrigen Zellzahlen keinen Einfluss auf die Fähigkeit hatten, behandelte von nicht behandelten Zellen anhand der Genexpression zu unterscheiden (ergänzende Abbildung 16a).

a TSNE-Diagramme normalisierter Genexpressionsdaten. Mit YM155 (linkes Feld), Blebbistatin (mittleres Feld) und mit der Kombination YM155-Blebbistatin behandelte Proben sind als repräsentative Beispiele gekennzeichnet. b Silhouette-Scores der Probenclusterung basierend auf Medikamenten und Kombinationen aus Autosampler/Braille-Ventilen. Die Silhouetten-Scores werden mit Zufallsverteilungen (Farbcode) verglichen, die durch Permutation von Probenbeschriftungen erstellt wurden. (c) ROC-Analyse der Ähnlichkeit der Arzneimittelsignatur mit LINCS-L1000-Daten. Für jedes Medikament wurde eine Konsenssignatur berechnet und die Ähnlichkeit (Rangkorrelation nach Spearman) mit den entsprechenden LINCS-L1000-Signaturen berechnet. Die Ähnlichkeitswerte wurden als vorhergesagte Werte für die ROC-Analyse verwendet, während echte Positive die übereinstimmenden Arzneimittelpaare zwischen dem Hochdurchsatz-Screen und LINCS-L1000 waren. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Um weiter zu untersuchen, ob die Genexpressionswerte des Hochdurchsatz-Screenings biologisch aussagekräftig sind, haben wir die erhaltenen Genexpressionssignaturen mit denen verglichen, die für dieselben Medikamente im öffentlichen LINCS-L1000-Datensatz8 verfügbar sind. Da LINCS-L1000 nur Expressionssignaturen von Monotherapie-Arzneimittelbehandlungen enthält, haben wir Konsenssignaturen für jedes Medikament unseres Hochdurchsatz-Screenings berechnet (Methoden der funktionellen genomischen Analyse von Genexpressionssignaturen) und diese mit Konsenssignaturen verglichen, die aus der LINCS-L1000-Datenbank generiert wurden alle verfügbaren Zelllinien und Konzentrationsdosen (beachten Sie, dass LINCS-L1000 keine Daten enthält, die direkt von K562-Zellen erhalten wurden). Für 32 Medikamente, die in unserem mikrofluidischen Screening verwendet wurden, lagen entsprechende Daten zu LINCS-L1000 vor. Um die Ähnlichkeiten dieser Signaturen zu vergleichen, haben wir die Korrelationskoeffizienten nach Spearman für alle Arzneimittelpaare in den beiden Datensätzen berechnet. Unsere ROC-Analyse zeigte, dass die Signaturen der gleichen Medikamente aus den beiden Screens (echt positiv) ähnlicher sind als die Signaturen nicht verwandter Medikamentenpaare (Abb. 5c, ROC AUC: 0,59), und dieser Bereich unter der ROC-Kurve ist im Vergleich statistisch signifikant zu einer zufälligen Verteilung, die durch Permutation der Arzneimitteletiketten erstellt wurde (ergänzende Abbildung 17, p = 0,019).

Zusammenfassend haben wir gezeigt, dass beim kombinatorischen Arzneimittelscreening mit hohem Durchsatz die Injektion (Braille-Ventil oder Autosampler) und der Barcode-Modus die Daten nicht verzerrten und dass die Korrelation der Arzneimittelsignaturen zwischen unseren Daten und LINCS-L1000 eine signifikante Ähnlichkeit aufwies. Folglich kamen wir zu dem Schluss, dass unser Combi-Seq-Ansatz zur Durchführung kombinatorischer Arzneimittelscreenings in großem Maßstab unter Verwendung von Material mit geringem Input und flacher RNA-Seq als Auslese angewendet werden kann.

Da es sich bei allen verwendeten Arzneimittelkonzentrationen um GR35-Werte handelte, erwarteten wir, dass synergistische Kombinationen zu einer verminderten Lebensfähigkeit der Zellen führen könnten, während wir im Fall antagonistischer Kombinationen erhöhte Werte für die Lebensfähigkeit der Zellen erwarteten. Obwohl wir die Lebensfähigkeit der Zellen nicht direkt gemessen haben, ermöglichte uns der CEVIChE-Algorithmus (Methods Functional Genomic Analysis of Gene Expression Signatures)18, aus den Genexpressionsdaten Änderungen der Zelllebensfähigkeit für alle verwendeten Arzneimittelkombinationen abzuleiten (ergänzende Abbildung 18), was für uns zuverlässig funktionierte niedrige Zellzahlen und war unabhängig vom Prozentsatz der nachgewiesenen mitochondrialen Gene (Ergänzende Abbildungen 16b, 19). Durch den Vergleich der vorhergesagten verringerten Lebensfähigkeit zwischen Arzneimittelkombinationen und Einzelmedikamentenbehandlungen ermittelten wir Synergiewerte für alle 420 Kombinationen (Abb. 6a). Wir fanden mehrere Cluster potenzieller synergistischer und antagonistischer Kombinationen (z. B. Triciribin-Dacarbazin bzw. Razoxan-Trametinib). Um die Vorhersagen zur Synergie des Hochdurchsatz-Arzneimittelscreenings experimentell zu validieren, führten wir kombinatorische Zelllebensfähigkeitsscreenings mit 5 × 5-Dosismatrix mit allen möglichen Kombinationen von Triciribin, YM155, Razoxan und Doxorubicin mit Dacarbazin, Imatinib und Trametinib in einem Mikrotiter durch Plattenformat.

eine Heatmap, die die vorhergesagten Synergiewerte zeigt, die durch den Vergleich der Wirksamkeit aller 420 Arzneimittelkombinationen mit den entsprechenden Einzelmedikamentenbehandlungen ermittelt wurden. b Korrelation zwischen experimenteller und vorhergesagter Zelllebensfähigkeit (Pearson-Korrelation r = 0,66, p = 0,018, R2 = 0,44). Die Arzneimittelsynergie (y-Achse) wurde für 12 Kombinationen in einem Mikrotiterplattenformat (Farbcode) gemessen und gegen den vorhergesagten Synergiewert (x-Achse) aufgetragen. Der schattierte Bereich zeigt ein 95 %-Konfidenzintervall der Regressionsschätzung. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Wir berechneten Synergiewerte (positiv: synergistisch, negativ: antagonistisch) für die getesteten 12 Kombinationen unter Verwendung des Bliss-Unabhängigkeitssynergiemodells (Methoden, plattenbasierte Lebensfähigkeitsmessungen zur Validierung von Treffern aus dem mikrofluidischen Screen)24. Unter den 12 validierten Kombinationen war Antagonismus häufiger, was mit zuvor veröffentlichten Daten vergleichbar ist (ergänzende Abbildung 20). Unsere 12 gemessenen (Plattenexperiment) und vorhergesagten (aus im Mikrofluidiksystem erhaltenen Genexpressionsdaten) Synergien zeigten eine signifikante Korrelation (Abb. 6b, Pearson-Korrelation r = 0,66, p = 0,018, Werte ohne Razoxane-Trametinib siehe Ergänzungstabelle 2). ). Der Vergleich bestätigte, dass die Kombinationen von Trametinib und Topoisomerase-2-Inhibitoren antagonistische Wirkungen zeigen, während die BCR-ABL-Hemmung (Imatinib) mit einer erhöhten Induktion von Apoptose durch die Hemmung von Survivin mit YM155 zusammenwirkt, was das Entdeckungspotenzial unserer Combi-Seq-Plattform weiter bestätigt.

Zusammenfassend haben wir mithilfe unserer kombinatorischen mikrofluidischen Genexpressionsplattform gezeigt, dass (i) die gemessenen Genexpressionswerte auf der Grundlage der chemischen Störung gruppieren, (ii) die resultierenden Daten gut mit öffentlichen Monotherapie-Störungsprofilen übereinstimmen und (iii) Die vorhergesagten Zelllebensfähigkeiten und Arzneimittelsynergien könnten in einem Multiwell-Plattenformat für ausgewählte Treffer validiert werden. Zusammengenommen veranschaulicht dies, wie umfassende Informationen aus Genexpressionsprofilen gewonnen werden können, die in einem hochmultiplexten Mikrofluidikformat erhalten werden, wobei nur etwa 250 Zellen pro Arzneimittelbehandlung sequenziert werden. Dies dürfte den Workflow insbesondere für den Einsatz mit sehr begrenztem Material, etwa Patientenproben, interessant machen.

Die Stratifizierung von Krebspatienten zur Personalisierung von Behandlungen mit Chemotherapeutika und zielgerichteten Arzneimitteln steigert nachweislich den Erfolg von Krebstherapien25,26,27. Diese Bemühungen basieren größtenteils auf der Analyse der genomischen und transkriptionellen Landschaft von Tumoren oder Zelllinien, um Merkmale zu identifizieren, die Arzneimittelempfindlichkeiten erklären28,29. Während eine Vielzahl identifizierter genomischer und/oder transkriptomischer Marker in Kliniken erfolgreich eingesetzt werden, sind sie nur für eine kleine Untergruppe von Tumortypen und Patienten verfügbar1. Darüber hinaus erleiden viele Patienten häufig einen Tumorrückfall30, der größtenteils auf die Heterogenität innerhalb des Tumors zurückzuführen ist31. Der Rückfall wird oft durch das Aufkommen eines Resistenzmechanismus gegen das Medikament verursacht, der die Wirksamkeit einzelner Medikamente kurzlebig macht32. Während Behandlungen mit Arzneimittelkombinationen das Potenzial bieten, das Risiko einer Arzneimittelresistenz zu verringern, bleiben deren Vorhersage und empirische Bewertung weiterhin eine Herausforderung.

Um bei der Lösung dieser Herausforderungen voranzukommen, präsentieren wir hier eine mikrofluidische Pipeline, die hochmultiplexierte kombinatorische Arzneimittelscreenings in Einzelzelltröpfchen unter Verwendung globaler Transkriptomik als Auslese ermöglicht. Durch die Integration deterministischer Barcodes von Behandlungsbedingungen konnten wir die Wirksamkeit von Arzneimittelkombinationen anhand von Veränderungen in der Genexpression beurteilen und umfassende Erkenntnisse aus der Sequenzierung des gesamten Transkriptoms gewinnen. Wir haben unsere Pipeline eingesetzt, um 420 kombinatorische Behandlungsbedingungen in einer einzigen Röhre zu screenen, was den hohen Grad an Multiplexing verdeutlicht. Basierend auf der Assay-Miniaturisierung im Tröpfchenformat wurden pro Testbedingung nur etwa 250 Zellen benötigt, was die Möglichkeit für personalisierte Screens direkt am Patientenmaterial eröffnet und den Maßstab, in dem kombinatorische Screens an vom Patienten stammenden Zelllinien oder Organoiden durchgeführt werden können, drastisch erhöht und Sphäroide.

Wir haben die Mikrofluidik-Plattform als modulares System konzipiert, bei dem die Braille-Anzeigeventile es uns ermöglichen, schnell zwischen injizierten Medikamenten zu wechseln und so die Einschränkungen einer langsamen Autosampler-basierten Injektion zu überwinden. Da beide auf dem Tröpfchengenerator kombiniert werden, ist eine schnelle und effiziente Generierung von Arzneimittelkombinationen möglich und ermöglicht die Einkapselung einzelner Zellen in Tröpfchen mit hoher chemischer Vielfalt. Da der hier verwendete Autosampler Medikamente aus bis zu drei 96- oder sogar 384-Well-Platten injiziert, kann die Anzahl der Medikamentenkombinationen weiter auf ein theoretisches Maximum von 3 × 384 × 20 = 23.040 Kombinationen in einem einzigen Experiment skaliert werden. Was bei dieser Größenordnung am meisten einschränkt, sind die Sequenzierungskosten und das verfügbare Material (z. B. bei der Verwendung von Primärzellen) und nicht der Gerätedurchsatz.

Wir sehen ein erhebliches zusätzliches Potenzial in der Möglichkeit, so viele Wirkstoffkombinationen auf Einzelzellebene zu screenen: Die Integration einer fluoreszenzbasierten Tröpfchensortierung vor dem Schritt der Pikoinjektion (Zelllyse) könnte beispielsweise zur physikalischen Trennung und Sequenzierung genutzt werden resistente Klone für alle 420 Behandlungsoptionen in einem einzigen Experiment (z. B. Implementierung des phänotypischen Caspase-3-Assays, den wir zuvor verwendet haben)14. Auf diese Weise könnte man den Unterschied in ihrer transkriptomischen Signatur im Vergleich zu antwortenden Zellen analysieren und so den Weg für hochmultiplexierte Studien ebnen, um neue Biomarker für Resistenzen und (chemische) Sensibilisatoren zu entdecken, um diese zu überwinden. Wie kürzlich gezeigt wurde, liefern Einzelzell-Auslesungen der Medikamentenstörung großartige Einblicke in die heterogene Medikamentenreaktion11. Die Durchführung solcher Screens an Patientenbiopsien wird es uns ermöglichen, den Einfluss der Tumorheterogenität auf die Arzneimittelreaktionen zu untersuchen und dadurch wirksamere Arzneimittelkombinationen zu definieren und darüber hinaus Einblicke in ihre potenziellen Resistenzmechanismen zu gewinnen. Um die Einkapselung primärer Tumorzellen (oder mikroskopischer Fragmente) und/oder deren Expansion zu Sphäroiden zu ermöglichen, streben wir die Integration von Stützstrukturen für die Zelladhärenz und das Wachstum in Tröpfchen an, wie zuvor gezeigt33,34.

Alle generierten Datensätze zeigen, dass weder der Barcode-Ansatz noch der Injektionsmodus die auf der Genexpression basierende Auslesung beeinflussten. Monotherapien sowohl im Injektions- als auch im Barcode-Modus hatten ähnliche Auswirkungen, während ihre Kombinationen den stärksten Einfluss auf die Genexpression hatten und der Hauptgrund für die beobachtete Häufung waren. Dies bestätigt die hochpräzise und genaue Funktionsweise des vorgestellten mikrofluidischen Arbeitsablaufs und die Spezifität des deterministischen Barcode-Ansatzes. Darüber hinaus fanden wir signifikante Ähnlichkeiten zwischen den Konsens-Genexpressionssignaturen von Monotherapien aus unserem groß angelegten Screening und den Arzneimittelsignaturen aus dem LINCS-L1000-Datensatz, was ein hohes Maß an Reproduzierbarkeit verdeutlicht. In der Pathway-Aktivitätsanalyse stellten wir fest, dass die hierarchische Clusterbildung größtenteils durch die drei Medikamente YM155, Imatinib und Trametinib bestimmt wurde, was die Erkennung arzneimittelspezifischer Wirkungen weiter unterstützt. Die beiden Hauptcluster wurden durch Trametinib-Behandlungen verursacht, die die Aktivitäten des MAPK- und EGFR-Signalwegs hemmten, und durch die gegensätzlichen Wirkungen von YM155-Behandlungen, die eine Hochregulierung der MAPK- und EGFR-Signalwegaktivitäten induzierten und gleichzeitig Hypoxie und TRAIL-bezogene Signalwege hemmten. Während die Auswirkungen von Trametinib auf MAPK zu erwarten sind35, sind die Auswirkungen der Survivin-Hemmung durch YM155 aufgrund der komplexen Signalübertragung und unvollständigen Kenntnisse über Survinin weniger gut verstanden36. Die erhöhte Aktivität des MAPK-Signalwegs spiegelt wahrscheinlich einen gegenwirkenden Mechanismus wider, da beschrieben wurde, dass die Survivin-Expression durch die Aktivierung von Sp1 und c-Myc über den MAPK-Signalweg reguliert wird37 und eine höhere Konzentration des Arzneimittelziels die Arzneimittelwirkung verringert. Da die Survinin-Expression mit Arzneimittelresistenz bei Leukämie in Verbindung gebracht wird, könnte eine kombinatorische Behandlung mit YM155 und Trametinib aufgrund der Hemmung der Survivin- und mutmaßlich kompensatorischen Expression, die durch den MAPK-Weg induziert wird, möglicherweise einen positiven Effekt auf die Verringerung der Wahrscheinlichkeit eines Rückfalls haben. Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass die beschriebene mikrofluidische Pipeline eingesetzt werden kann, um die Auswirkungen von Arzneimittelkombinationen auf Signalwegaktivitäten zu entwirren. Solche Informationen werden beim Screening von Patientenbiopsien von großer Bedeutung sein, um potenzielle Resistenzmechanismen zu identifizieren und wirksame Arzneimittelpaare vorherzusagen. Die Analyse der Signalwegaktivitäten bei Störungen war durch die Anzahl der erkannten Gene und daher auf die kleinen 4 × 4-Screens beschränkt, da diese Proben in größerer Tiefe sequenziert wurden. Um eine vergleichbare Anzahl an Genen für alle 420 Wirkstoffkombinationen zu erfassen, wäre eine zehnmal höhere Abdeckung nötig gewesen. Wir haben stattdessen den großen Bildschirm verwendet, um zu zeigen, dass flache Sequenzierungsdaten ausreichen, um synergistische Arzneimittelpaare zu bestimmen. Wir haben den Datensatz mit 420 Behandlungsbedingungen nach Arzneimittelpaaren mit synergistischen oder antagonistischen Wirkungen durchsucht. Wir fanden heraus, dass die Kombination von Trametinib mit Topoisomerase-2-Hemmern (Top2-Hemmern) (Doxorubicin oder Razoxan) antagonistische Wirkungen hat (Abb. 6b). Wir gehen davon aus, dass die Hemmung des MAPK-Signalwegs durch Trametinib und der daraus resultierende Stillstand des G1-Zellzyklus dem DNA-Schaden entgegenwirkt, der normalerweise durch die Top2-Hemmung verursacht wird, wenn Zellen in die nachfolgende S-Phase eintreten. Unter den vorhergesagten und validierten synergistischen Kombinationen fanden wir die Kombination von Triciribin mit Dacarbazin und YM155 mit Imatinib zu den Top-Hits (Abb. 6b). BCR-ABL (das Ziel von Imatinib) wurde zuvor mit einer Hochregulierung der Expression von Survivin (dem Ziel von YM155) in Verbindung gebracht38. Daher wurde festgestellt, dass Survivin-Antisense-Silencing die Lebensfähigkeit verringert und die Wirksamkeit der Imatinib-Behandlung bei Zelllinien mit chronischer myeloischer Leukämie (CML) sowie bei myeloischen Vorläufern von CML-Patienten erhöht39,40. Durch die Bestätigung einer zuvor beschriebenen effizienten Behandlungskombination für CML, die das Potenzial hat, das Auftreten einer Imatinib-Resistenz zu verhindern, veranschaulichen wir das Potenzial unserer Pipeline bei der Identifizierung klinisch relevanter Arzneimittelpaare. Darüber hinaus haben wir bestätigt, dass eine gute Korrelation zwischen den Lebensfähigkeitswerten aus den Genexpressionsdaten und den experimentell validierten Synergiewerten aus dem plattenbasierten Arzneimittelscreening besteht. Diese Ergebnisse zeigen, dass es möglich ist, in großen Transkriptomik-Screenings kostengünstig eine geringe Sequenzierungstiefe zu nutzen, um synergistische Wirkstoffpaare zu entdecken.

Zusammen mit den abgeleiteten Signalwegaktivitäten unter Störung sollte dies nicht nur die Identifizierung synergistischer Kombinationen ermöglichen, sondern auch Einblicke in deren Wirkmechanismen gewinnen. Im Vergleich zu unserer vorherigen Plattform für phänotypische Assays mit Einzelmessungen14 liefert die globale transkriptomische Auslesung um Größenordnungen mehr Datenpunkte pro Probe, während der Zellverbrauch weiter um den Faktor sechs reduziert werden könnte. Die höheren Inhaltsauslesungen sollten fundiertere Vorhersagen über die besten kombinatorischen Behandlungen und die Entdeckung neuer Arzneimittelsensibilisatoren und Biomarker ermöglichen, und der noch geringere Materialbedarf erleichtert die Anwendung in der Klinik zur Patientenstratifizierung und Behandlungspriorisierung weiter.

Alle für das Ventilmodul verwendeten Geräte wurden aus Formen nachgebildet, die mithilfe der Softlithographie mit dem positiven Fotolack AZ-40XT (Microchemicals) gemäß den Anweisungen des Herstellers hergestellt wurden. Strukturen aus 25400-dpi-Fotomasken (Selba) wurden auf 4-Zoll-Siliziumwafern (Siltronix) in einem Mask Aligner (Suess MicroTec MJB3) unter Verwendung von Licht mit einer Wellenlänge von 375 nm strukturiert. Die Strukturen wurden mit einer etwa 1 cm dicken Schicht PDMS bedeckt, gemischt mit einem Härter im Verhältnis 1:10 (Sylgard 186 Elastomer-Kit, Dow Corning Inc) und über Nacht bei 65 °C ausgehärtet. Darüber hinaus haben wir PDMS-Membranen hergestellt, indem wir PDMS mit einem Härter im Verhältnis 1:10 gemischt und mit einem Spincoater bei 500 U/min (Laurell WS 650) auf einer transparenten Folie verteilt haben, die über Nacht bei 65 °C ausgehärtet wurden. Die Medikamenteneinlass- und -abflussöffnungen des Ventilchips wurden mit einer 0,75-mm-Biopsiestanze (Harris Unicore) gestanzt, während die Stopfenauslassöffnung mit einer 0,5-mm-Biopsiestanze (Harris Unicore) horizontal zu den Auslasskanälen gestanzt wurde. Die Chips wurden mithilfe eines Plasmaofens (Diener Femto) an eine PDMS-Membran gebunden. Wir führten PTFE-Schläuche mit einem Innendurchmesser von 0,4 mm (Adtech) in die horizontal gestanzte Auslassöffnung ein, bis der Schlauch die trichterartige Struktur des Auslasskanals erreichte. Anschließend wurden die Chips an einen Glasobjektträger gebunden, um Chipstrukturen mit Ein- und Auslässen zu unterstützen. Um eine Oberflächenbenetzung zu verhindern, wurden die Kanäle vor der Verwendung mit Aquapel (PGG Industries) behandelt. Die Ventilstrukturen von Braille-Chips wurden auf den Stiften einer Braille-Anzeige (KGS Corporation, ergänzende Abbildung 21a) ausgerichtet (ergänzende Abbildung 2a) und mit einem Plexiglashalter montiert (ergänzende Abbildung 21b). Mit unserer Software „CombinatorialPlugFluidics“ LabVIEWTM 2013 (alle benötigte Software kann unter www.epfl.ch/labs/lbmm/downloads heruntergeladen werden). Die Bewegung der Stifte wurde gesteuert, sodass das Öffnen des Sammelkanals zum Schließen des Abfallkanals führte und umgekehrt. Das Schließen eines Kanals wurde durch das Eindrücken eines Stifts in die elastische PDMS-Membran erreicht. Durch Herunterschieben des Stiftes konnte dieser wieder geöffnet werden. Für alle Experimente verwendeten wir 20 Spritzen (Becton Dickinson), gefüllt mit 5 ml Arzneimittel-Barcode-Lösungen, und vier Spritzen, gefüllt mit 5 ml HFE-Öl (Novec™ 7500, 3 M). Diese wurden mit PTFE-Schläuchen an die Einlassöffnungen des Ventilchips angeschlossen und mit Spritzenpumpen (Harvard Apparatus) wurden Flüssigkeiten in einer Menge von 500 µl pro Stunde injiziert. Die Abfallauslässe waren mit einem Stück PTFE-Schlauch verbunden, um Flüssigkeiten in einen Abfallbehälter zu leiten.

Tropfenmacherformen wurden aus negativem Photoresist SU-8 2075 hergestellt, wie vom Hersteller (Microchemicals) beschrieben. PDMS mit einem Härter von 10 % (Gew./Gew.) wurde über die Formen gegossen und über Nacht ausgehärtet. Einlassanschlüsse für Zellen und HFE wurden vertikal mit 0,75- oder 1-mm-Biopsiestanzen für PEEK-Schläuche gestanzt, die vom Anschluss des Autosamplers stammen. Einlassöffnungen für Verbundstopfen der Braille-Ventile wurden horizontal mit 0,5-mm-Stanzern gestanzt. Die Chips wurden zunächst an eine PDMS-Membran und anschließend an einen Glasobjektträger plasmagebunden. Die Hydrophobie der Kanalwände wurde durch die Injektion von Aquapel (PGG Industries) in die Kanäle erhöht.

Um die Injektion von Medikamenten aus Mikrotiterplatten in das Drop-Maker-Gerät zu erleichtern, verwendeten wir einen Dionex 3000SL Autosampler, der Medikamente aus einer 96-Well-Platte ansaugte. Der Autosampler wurde so programmiert, dass er nacheinander 310 µl der Verbindung aus den Vertiefungen in eine 125 µl-Probenschleife aufsaugt. Der große Überschuss an angesaugtem Volumen führte zu einem Nadelvolumen von 60 µl und einem Schleifenüberfüllungsfaktor von 2. Durch Überfüllen der Probenschleife um das Doppelte ihres Volumens stellten wir sicher, dass die verbleibende Verbindungsmischung nicht durch die in der Probenschleife verbleibenden Trägerflüssigkeiten verdünnt wurde Probenschleife nach jedem Zyklus aufgrund des Waschens. Die Injektion von Verbindungen aus der Probenschleife in den Tröpfchenerzeuger erfolgte durch eine Spritzenpumpe (Harvard Apparatus), die PBS (Thermo Fisher) mit 500 µl pro Stunde injizierte. Nach der Aufnahme eines Medikaments begann eine Verzögerungszeit, um sicherzustellen, dass jedes Medikament injiziert und mit allen Medikamenten aus der Braillezeile kombiniert wurde, bevor das nächste Medikament aspiriert wurde.

Mit dem bgen-Tool (gear.embl.de) wurden zufällige 10 nt lange DNA-Sequenzen mit ausgewogenen Basenverteilungen generiert. PCR-Primer mit Barcode wurden zur Reinigung mit einem 5'-Ende-Biotin funktionalisiert, gefolgt von einer Spacer-Sequenz, einer gemeinsamen Primersequenz, einer eindeutigen Barcode-Sequenz und einer Ligationsstelle (Tabelle 2). Die umgekehrten Komplemente (RC) wurden mit einem freien 5′-Endphosphat funktionalisiert, um die Ligation zu ermöglichen. RT-Primer mit Barcodes umfassten eine dT(20)-VN-Sequenz, eine einzigartige Barcode-Sequenz und eine Phosphatgruppe am 5′-Ende. Der RC dafür hatte eine Ligationsstelle, die zur Ligationsstelle der PCR-Primer komplementär war. Eine Auflistung aller Barcode-Sequenzen finden Sie in den ergänzenden Materialien. Komplementäre Sequenzen wurden bei äquimolaren Konzentrationen getempert, indem die Mischungen 10 Minuten lang in einem Thermoblock (Eppendorf) auf 95 °C erhitzt und anschließend 1 Stunde lang auf Raumtemperatur (RT) abgekühlt wurden.

Barcode-Arzneimittelmischungen für das Ventilmodul wurden durch Verdünnen von Barcode-RT-Primern in FreeStyle-Medien (Thermo Fisher) auf 1 µM hergestellt. In DMSO gelöste Arzneimittel wurden dem entsprechenden Barcode in doppelter Endkonzentration hinzugefügt (siehe ergänzende Materialien). Die Barcode-Arzneimittelmischungen wurden zu Überwachungszwecken entweder mit Cascade-Blue (Thermo Fisher) oder Alexa-488 (Thermo Fisher) bei 10 µM ergänzt und anschließend mit 27 G in 5-ml-Luer-Lock-Spritzen (BD) abgesaugt, die mit PTFE-Schläuchen verbunden waren ¾ Nadeln (BD). Barcode-Arzneimittelmischungen für die Autosampler-basierte Injektion wurden in 96-Well-Rundbodenplatten hergestellt, indem die Barcode-PCR-Primer in FreeStyle-Medien auf 4 µM und die entsprechenden Arzneimittel auf das Vierfache der Endkonzentration verdünnt wurden. Die Mischungen wurden mit Alexa-488 in einer Konzentration von 10 µM ergänzt und die Platten wurden mit selbstklebenden qPCR-Siegeln (Thermo Fisher) versiegelt.

K562-Zellen (ATCC, CCL-243) wurden in IMDM-Medium (Thermo Fisher), ergänzt mit 10 % FBS (Thermo Fisher) und 1 % Penicillin-Streptomycin (Thermo Fisher), kultiviert. Am Tag der Experimente wurden die Zellen zweimal in PBS gewaschen und in FreeStyle Media (Thermo Fisher), ergänzt mit 4 % FBS, resuspendiert. Die Konzentration der Zellsuspension wurde auf 2 × 106 Zellen ml−1 eingestellt und anschließend in eine 3 ml Luer-Lock-Spritze (BD) abgesaugt.

Spritzen, die Arzneimittel-Barcode-Mischungen und HFE-Öl enthielten, wurden wie in Abb. 1c gezeigt an den Braille-Ventilchip angeschlossen und alle mit 500 µl h−1 injiziert. Der Standardmodus für alle Verbundventile bestand darin, Flüssigkeiten zu den Abfallauslässen zu leiten, und zwei HFE-Ölventile, um Flüssigkeiten zu den Auslassschläuchen zu leiten. Die Länge des Auslassschlauchs des Braille-Ventils wurde angepasst, um alle 20 mit HFE-Öl beabstandeten Verbundstopfen aufzunehmen, und dann mit dem Braille-Einlass auf dem Drop-Marker-Chip verbunden (ergänzende Abbildung 21b). Eine Spritze mit Zellen wurde auf eine Pumpe montiert, mit dem Tropfenmacher verbunden und mit 500 µl pro Stunde injiziert. Die Zellsedimentation wurde durch langsame Rotationen der Magnetscheibe unter Verwendung des Multi Stirrus™-Systems (VP ​​Scientific) verhindert. Die Ausgangsschläuche des Autosamplers und die mit 1 % Pico-Surf1 (Sphere Fluidics) ergänzte HFE-Trägerphase wurden über die jeweiligen Einlässe verbunden und mit 500 bzw. 6000 µl h−1 injiziert. Der Tröpfchenmacher-Chip wurde auf einem Mikroskop (Nikon, Eclipse Ti2-E) mit einem optischen Aufbau zur Messung der Fluoreszenzintensität von Verbindungspfropfen oder Tröpfchen montiert14. Laser mit einer Wellenlänge von 375 oder 488 nm wurden zur Anregung von Farbstoffen verwendet und das emittierte Licht (450 oder 520 nm) wurde mit Photomultiplierröhren gemessen. Die Laser wurden auf eine der drei in Abb. 1c gezeigten Positionen (M1–M3) fokussiert, um Fluoreszenzfarbstoffe zu messen, die zusammen mit den Arzneimittel-Barcode-Mischungen in den Tropfenmacher injiziert wurden. An den Positionen M1 und M2 wurden Fluoreszenzsignale mit der Software PlugAcquisition LabViewTM 2014 aufgezeichnet. Fluoreszenzsignale von Tröpfchen wurden an Position M3 mit der Software DropletAcquisition LabViewTM 2014 erfasst (die gesamte erforderliche Software kann von www.epfl.ch/labs/lbmm/downloads heruntergeladen werden).

Eine CSV-Datei mit der Öffnungssequenz des Braille-Ventils (Tabelle 3) wurde in die Beispiel-On-Demand-Software geladen. Die Anzahl der Zyklen wurde auf 21 festgelegt, da wir alle 20 Medikamente aus den Braille-Ventilen mit 21 Medikamenten aus einer 96-Well-Platte kombinierten. Sobald alle Schläuche angeschlossen waren und Flüssigkeiten in den Tropfenmarker injiziert wurden (Trägerflüssigkeit vom Autosampler und HFE-Öl von den Braille-Ventilen), wurde gleichzeitig mit der Stopfenproduktion und der Autosampler-basierten Injektion begonnen. 20 Pfropfen wurden in den Verzögerungsschlauch erzeugt (180 s) und anschließend in den Tropfenmacher injiziert, indem zwei HFE-Ölventile geöffnet wurden (Gesamtflussrate 1000 µl h−1). Dies stellte eine kontinuierliche und stabile Flussrate für Pfropfeninjektionen sicher und führte daher zu einem laminaren Fluss von Verbindungen aus den Braille-Ventilen, Autosampler-Verbindungen und Zellen, aus denen an der Flussfokussierungsverbindung Tröpfchen erzeugt wurden (Film S1). Tröpfchen von etwa 800 μl wurden in einem Eppendorf-Röhrchen gesammelt, das auf Eis stand. Sobald 420 Kombinationen erzeugt waren (~100 Min.), wurde das Eppendorf-Röhrchen in einen befeuchteten Inkubator bei 37 °C und einer 5 % CO2-Atmosphäre gestellt, um die Zellen 12 Stunden lang zu inkubieren.

Chips für die Pikoinjektion wurden durch Nachbildung von SU-8-Formen unter Verwendung von PDMS mit einem Härter wie oben beschrieben hergestellt. Die Abgüsse wurden an Glasobjektträger plasmagebunden und mit Aquapel behandelt. Die Chips wurden auf 95 °C erhitzt und das erste niedrig schmelzende Lot und zweite Kabel wurden in die Anschlüsse für die beiden Elektroden eingeführt (ergänzende Abbildung 22). Der Chip wurde auf dem Mikroskop einer Mikrofluidikstation montiert und die Leistungselektrode an einen Hochspannungsverstärker angeschlossen, während der Chip über die Erdungselektrode geerdet wurde.

Nach einer Inkubation von 12 Stunden wurden Tröpfchen mit Zellen, Arzneimittelkombinationen und entsprechenden DNA-Barcodes in eine 3-ml-Spritze überführt und durch die Tröpfcheneinlassöffnung in einen Pikoinjektionschip injiziert (ergänzende Abbildung 2). Die Tröpfchen wurden mit 180 µl h−1 gespült und einzelne Tröpfchen durch Injektion von HFE-Öl mit 1 % PicoSurf-Tensid bei 700 bis 1000 µl h−1 über den Öleinlass verteilt. Für die Zelllyse, die Barcode-Ligation und die reverse Transkription der aus lysierten Zellen freigesetzten mRNA haben wir eine Eintopf-Reaktionsmischung mit 0,9 % Igepal (Sigma Aldrich), 3x Ligationspuffer (NEB) und 60.000 U/µl T4-Ligase ( NEB), 1,5 mM dNTPs (Thermo Fisher), 7,5 µM Template Switching Oligonucleotid (IDT), 12 U/µl Maxima-H Reverse Transkriptase (Thermo Fisher) und 6000 U/µl NxGen RNase Inhibitor (Lucigen). Die Flussraten für die Reagenzmischung wurden entsprechend der Tröpfchenfrequenz und -größe angepasst, um das Äquivalent von 1/3 des endgültigen Tröpfchenvolumens zu injizieren (Film S3). Um die Injektion von Reagenzien in die an der Injektordüse vorbeiströmenden Tröpfchen zu erreichen, haben wir mithilfe eines Funktionsgenerators (Rigol) ein kontinuierliches elektrisches Feld von 0,1 V angelegt. Die Picoinjektion wurde über einen Zeitraum von ca. 1 Stunde durchgeführt, wobei alle Tröpfchen (Injektion und Sammlung) auf Eis gehalten wurden. Anschließend wurde die Emulsion 30 Minuten bei RT gehalten und dann 90 Minuten bei 42 °C inkubiert.

Arzneimittelaustauschexperimente wurden wie die beschriebenen kombinatorischen Arzneimittelscreens mit kleinen Anpassungen durchgeführt: Die verschiedenen Arzneimittel wurden nur aus dem Autosampler injiziert, während nur mit BC-15 oder BC-O und DMSO angereicherte Medien kontinuierlich aus dem Braille-Einlass mit einer normalen Spritze injiziert wurden Pumpe anstelle der Braillezeile. Emulsionen aller Proben wurden in einzelnen Vertiefungen von 96-Well-Platten gesammelt, 24 Stunden lang bei 37 °C in einer 5 % CO2-Atmosphäre inkubiert, gepoolt und dann wie für die kombinatorischen Wirkstoffscreens beschrieben verarbeitet.

Zuerst wurden 10 µl BC-PCR und 5 µl BC-RT, beide 20 µM, in die jeweiligen Vertiefungen einer 96-Well-Platte gegeben, gefolgt von 4 µl aus einem der entsprechenden 50-fachen Wirkstoffvorräte von Imatinib, Trametinib oder YM155 (Tabelle S4). K562-Zellen wurden in FS-Medium mit 1 % (Gew./Vol.) FBS auf eine Konzentration von 1050 Zellen/µl resuspendiert. Für jede Vertiefung, die die Mischung aus Medikamenten und Barcodes enthielt, wurden 181 µl dieser Zellsuspension hinzugefügt und dann 12 Stunden lang bei 37 °C in einer 5 % CO2-Atmosphäre inkubiert. Um die Effizienz zu steigern, wurden zunächst Zelllyse und Ligation durchgeführt, gefolgt von Reinigungs- und Waschschritten, bevor die reverse Transkription durchgeführt wurde. Insbesondere wurden 20 µl Zellen in eine Vertiefung überführt, die 10 µl 0,9 % Igepal (Sigma Aldrich), 3x Ligationspuffer (NEB), 60.000 U/µl T4-Ligase (NEB) und 6000 U/µl NxGen RNase-Inhibitor enthielt (Lucigen) für Zelllyse (10 Min. auf Eis) und Barcode-Ligation (30 Min. bei RT). Den Gemischen wurden etwa 200 µl 6x SSC zugesetzt, bevor sie zur 5-minütigen Zentrifugation bei 2000 × g in 1,5-ml-Eppendorf-Röhrchen überführt wurden. Die Überstände wurden in frische Eppendorf-Röhrchen, ergänzt mit 50 µl C1-Dynabeads zu 10 µg µl-1 in 6x SSC-Puffer, überführt und 15 Minuten bei RT auf einem Nutator (VWR) inkubiert. Die Perlen wurden dreimal in 6x SSC-Puffer gewaschen, kurz in einer Tischzentrifuge zentrifugiert und dann in 80 µl Reverse-Transkriptions-Mix resuspendiert, der 1x Maxima RT-Puffer (Thermo Fisher), 4 % Ficoll-PM 400 (Sigma Aldrich), 1 enthielt mM dNTPs, 2000 U/µl NxGen RNase-Inhibitor (Lucigen), 2,5 µM Template Switching Oligonucleotid (IDT) und 4 U/µl Maxima-H Reverse Transkriptase (Thermo Fisher). Die Mischungen wurden unter Nutation (VWR) 30 Minuten bei RT und 90 Minuten bei 42 °C inkubiert. Die Perlen wurden zweimal in TE-SDS (10 mM Tris pH 8,0, 1 mM EDTA und 0,5 % SDS) und zweimal in nukleasefreiem Wasser (Thermo Fisher) gewaschen, bevor cDNA aus verschiedenen Bedingungen gepoolt und für Bibliotheksvorbereitungen verarbeitet wurde, wie in beschrieben den Abschnitt „Bibliotheksvorbereitung und -sequenzierung“.

K562-Zellen wurden wie im Abschnitt „Herstellung von Zellsuspensionen“ beschrieben kultiviert. Am Tag der Experimente wurden die Zellen in PBS gewaschen und in „FreeStyle Media (Thermo Fisher)“, ergänzt mit 1 % FBS, resuspendiert. Zum Vergleich von Combi-seq- und PolyA-basierten RNA-Einfangstrategien wurden 250 Zellen/μl in eine überführt Eppendorf-Röhrchen und gemischt mit einer 5-μl-Lösung, die die entsprechenden Medikamente oder DMSO enthält, zusammen mit Combi-Seq- oder PolyA-Seq-Barcodes, suspendiert in FreeStyle-Medien, 1 % FBS. Nach 16 h Inkubation bei 37 °C und 5 % CO2-Atmosphäre, Die Zellen wurden mit 15 μl der Lösung, die Lysepuffer, Ligase und Reverse Transkriptase enthielt, wie im Tröpfchenexperiment gemischt (Einzelheiten siehe Abschnitt „Picoinjektion zur Zelllyse, Barcode-Ligation und Reverse Transkription“).

ERCC-Spike-Ins (Thermo Fisher, Kat.-Nr. 4456739) wurden im Verhältnis 1:100 in RNase-freiem Wasser verdünnt. Anschließend wurden 30 μl der verdünnten ERCC-Spike-Ins zu insgesamt 600 μl des Eintopf-Reaktionsmixes hinzugefügt. Diese Reaktionsmischung wurde in einem Verhältnis von 1:3 zu einem Tröpfchen Pico-injiziert, wie im Abschnitt „Pico-Injektion für Zelllyse, Barcode-Ligation und Reverse Transkription“ beschrieben.

Bei der umgekehrten Transkription der mRNA wurde die gesamte cDNA entsprechend der medikamentösen Behandlung mit einem Barcode versehen, und daher brachen wir die Emulsion durch Zugabe von 0,5 bis 1 ml 1H,1H,2H,2H-Perfluoroctanol (Abcr) auf. Der Überstand wurde in ein frisches Eppendorf-Röhrchen überführt, mit dem 1-fachen Volumen an C1-Dynabeads (Thermo Fisher) zu 2,5 µg µl−1 in 6x SSC-Puffer (Thermo Fisher) ergänzt und 20 Minuten bei RT inkubiert. Die Perlen wurden 2x in TE-SDS (10 mM Tris pH 8,0, 1 mM EDTA und 0,5 % SDS) und 2x in nukleasefreiem Wasser (Thermo Fisher) gewaschen. Die Perlen wurden bei 5 µg µl-1 resuspendiert, gefolgt von einem MseI (NEB)-Verdau gemäß den Anweisungen des Herstellers. Der Überstand wurde 2x mit SPRIselect-Perlen (BD) gereinigt, zuerst mit dem 0,6-fachen und dann mit dem 0,8-fachen des cDNA-Volumens, und schließlich in KAPA HiFi-Fertigmischung (Roche) mit 0,8 µM SMART-Primer (Ergänzungstabelle 3) über a amplifiziert insgesamt 13 Zyklen (PCR-Programm in Ergänzungstabelle 4). Die Produkte wurden auf SPRIselect-Perlen mit dem 0,6-fachen Volumen gereinigt und dann mit hochempfindlichen DNA-Chips auf einem 2100 Bioanalyzer (Agilent) analysiert. Die Fragmentierung der cDNA wurde durchgeführt, um die Fragmente zu verkürzen und Linkersequenzen einzuführen. Dies wurde mithilfe eines im Haus entwickelten Tn5-basierten Tagmentierungsprotokolls für 3′-Endbibliotheken erreicht41. Fragmente wurden unter Verwendung eines P5-SMART-Primers (Ergänzungstabelle 3) und eines i7-indizierten P7-Adapterprimers (Illumina, Ergänzungstabelle 3) bei 0,75 µM in KAPA HiFi-Fertigmischung (PCR-Programm, Ergänzungstabelle 4) amplifiziert. Die Fragmente wurden auf dem 1-fachen Volumen von SPRIselect-Perlen gereinigt und die Größenverteilungen wurden mit einem Bioanalyzer bestimmt. Alle Replikate wurden in äquimolaren Verhältnissen gepoolt und auf einem NextSeq 500-Gerät (Illumina) zusammen mit 10 % PhiX-Spike-Ins sequenziert. Die Paired-End-Sequenzierung wurde durchgeführt, indem die Barcode-Kombination (Read 1, 26 bp) unter Verwendung des benutzerdefinierten Sequenzierungsprimers (Ergänzungstabelle 3) und der mRNA (Read 2, 59 bp) sequenziert wurde.

In Boxplots stellt die Mittellinie den gemessenen Median dar, und die oberen und unteren Boxscharniere entsprechen dem ersten und dritten Quartil. Die von den unteren und oberen Scharnieren der Box ausgehenden Whisker repräsentieren den 1,5-fachen Interquartilbereich. Die Punkte mit den Linien im Geigendiagramm in Abb. 2d entsprechen dem Mittelwert mit Standardabweichung für jede der gemessenen Kreuzkontaminationen.

Wir verwendeten die SCANPY-Pipeline42 für die Vorverarbeitung der Genexpression und die Qualitätskontrolle. Proben mit geringer Genzahl und einem hohen Anteil an mitochondrialen Genen (>15 Prozent) sowie Gene mit einer hohen Dropout-Rate wurden herausgefiltert. Die Lesezahlen wurden basierend auf der Sequenzierungstiefe und der Z-Score-Transformation normalisiert. Der Batch-Effekt (Replikate) wurde durch die Verwendung der Kampffunktion von SCANPY entfernt. Zur Dimensionsreduzierung verwendeten wir die Hauptkomponentenanalyse, gefolgt von t-verteilter stochastischer Nachbareinbettung (TSNE)43. Zusätzliche Datenanalysen wurden in benutzerdefinierten Python 3.7-Skripten unter Verwendung von NumPy44 und Pandas als Statistikmodellbibliotheken durchgeführt.

Um die Häufung von Proben basierend auf den verschiedenen Faktoren (Autosampler-Medikament, Brailleventil-Medikament, Kombination) zu analysieren, verwendeten wir die Silhouette-Score-Analyse. Der Silhouettenkoeffizient (b − a)/max(a,b) wurde für jede Probe berechnet, wobei a der mittlere Intra- und b der mittlere Abstand zum nächsten Cluster war. Für jeden Clusterfaktor wurde der Durchschnitt der Silhouette-Koeffizienten berechnet (scikit-learn Python-Bibliothek). Da der Silhouette-Score von der Anzahl der Cluster abhängt, haben wir zufällige Cluster erstellt, indem wir die Stichprobenbezeichnungen und damit die Cluster-Mitgliedschaft permutiert haben.

Die Pathway-Aktivitäten wurden mit der PROGENy-Methode berechnet17,18,19. Die Aktivitäten einzelner arzneimittelspezifischer Signalwege wurden durch Anpassen eines linearen Modells (pathway_activity ~ YM155 + Imatinib + Trametinib) berechnet.

Um die Ähnlichkeit zwischen Genexpressionssignaturen aus dem Hochdurchsatz-Screening und dem LINCS-L1000-Datensatz8 zu vergleichen, haben wir Konsenssignaturen für jedes Medikament des Hochdurchsatz-Screenings berechnet. Um Konsenssignaturen zu berechnen, haben wir für jedes Gen der Expressionsmatrix ein lineares Modell (gene_expression ~ Drug1 + Drug2 + … + Drugn) angepasst und die linearen Modellkoeffizienten als arzneimittelspezifische Signaturen verwendet. Um Signaturähnlichkeiten zu vergleichen, haben wir den Rangkorrelationskoeffizienten nach Spearman zwischen den Arzneimittelsignaturen des Hochdurchsatz-Screenings und den LINCS-L1000-Signaturen berechnet. Die Ähnlichkeitswerte wurden als vorhergesagte Werte für die ROC-Analyse verwendet, während echte Positive die übereinstimmenden Arzneimittelpaare zwischen dem Hochdurchsatz-Screen und LINCS-L1000 waren.

Für Vorhersagen der Zelllebensfähigkeit verwendeten wir die CEVIChE-Methode. CEVIChE sagt die Lebensfähigkeit von Zellen anhand von Genexpressionsänderungen voraus, basierend auf einem linearen Modell, das auf einer großen Anzahl übereinstimmender Datensätze zur Zelllebensfähigkeit und Genexpression trainiert wird18. Da die gemessenen Gene des Hochdurchsatz-Screenings eine geringe Überlappung mit den im ursprünglichen CEVIChE-Modell verwendeten Genen zeigten, haben wir CEVIChE neu trainiert und dabei nur die im Hochdurchsatz-Screening gemessenen Gene verwendet. Dieses neu trainierte CEVIChE-Modell zeigte eine mit der ursprünglichen Methode vergleichbare Leistung (Pearson-Korrelation zwischen vorhergesagter und beobachteter Zelllebensfähigkeit: 0,31).

Für jede Kombination wurden im Voraus Arzneimittelplatten in einem 4 × 4-Schachbrettmuster vorbereitet, sodass nach der Zugabe der Zellen jedes Arzneimittel in seiner GR35-Konzentration und einer vierfachen Verdünnungsreihe davon vorlag. Jede Platte enthielt außerdem Medien und DMSO-Negativkontrollen sowie Monotherapien für jedes Medikament. K562-Zellen wurden am Tag vor jedem Experiment passagiert. Am Tag des Experiments wurden die Zellen einmal mit PBS gewaschen und dann in FreeStyle 293-Medium (Thermo Fisher) mit 1 % FBS resuspendiert. Zellen wurden mithilfe der Mehrschrittfunktion einer Mehrkanalpipette zu jeder vorbereiteten Arzneimittelplatte hinzugefügt, sodass jede Vertiefung ein Endvolumen von 200 µL und etwa 2 × 104 Zellen aufwies. Das Reservoir, aus dem die Zellen abgesaugt werden sollten, wurde häufig mit einer frisch resuspendierten Stammlösung aufgefüllt, um sicherzustellen, dass die Zellen in Suspension blieben. Die Platten wurden mit einer gasdurchlässigen Folie (Sigma) versiegelt und 48 Stunden lang inkubiert. Um eine Verdunstung zu verhindern, wurden die Platten im Inkubator in einer Box mit ca. 1 cm Wasser gehalten und innerhalb der Box ruhten die Platten auf Spitzenboxen. Nach der Inkubation wurden 22 µl Zelllebensfähigkeitsreagenz PrestoBlue (Thermo Fisher) in jede Vertiefung gegeben, die Platten wurden wieder verschlossen und für eine Stunde in den Inkubator zurückgebracht. Die Platten wurden dann mit einem Tecan-Mikroplattenlesegerät mit Anregungs-/Emissionswellenlängen von 535/615 nm (20 bzw. 10 nm Wellenlängenbandbreite) gelesen. Basierend auf der gemessenen Zelllebensfähigkeit für Monotherapien haben wir die erwartete Zelllebensfähigkeit mithilfe des Bliss-Unabhängigkeitsmodells24 für jede Kombination und jedes Konzentrationspaar berechnet. Der Unterschied zwischen erwarteter und gemessener Zelllebensfähigkeit für Kombinationen wurde über alle Konzentrationen gemittelt und als Synergiewert angegeben.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Die in dieser Studie generierten RNA-Sequenzierungsdaten wurden in der GEO-Datenbank unter dem Zugangscode GSE174696 hinterlegt. Die an den Mikrofluidikstationen erfassten fluoreszenzspektrometrischen Daten und die in dieser Studie generierten Lebensfähigkeitsmessungen von Zellen in Platten sind in der Quelldatendatei enthalten. Die logD-Werte der in dieser Studie verwendeten Medikamente sind in der ChEMBL-Datenbank verfügbar45. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

Mikrofluidische Steuerungssoftware kann unter www.epfl.ch/labs/lbmm/downloads heruntergeladen werden. Die CAD-Dateien für die Mikrofluidik-Chips sind bei Zenodo erhältlich: https://zenodo.org/record/6845607#.YtWZlMFBz1K. Der zur Analyse der transkriptomischen Daten verwendete Code kann von https://github.com/saezlab/Combi-Seq-analysis46 heruntergeladen werden.

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Szalai, B. Combi-Seq für die multiplexierte Transkriptom-basierte Profilierung von Arzneimittelkombinationen unter Verwendung deterministischer Barcodes in Einzelzelltröpfchen. GitHub https://doi.org/10.5281/zenodo.6761914 (2022)

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Wir danken allen Mitgliedern der Genomics Core Facility am EMBL für ihre Hilfe bei der Vorbereitung von Bibliotheken und der Sequenzierung unserer Proben, der elektronischen und mechanischen Werkstatt des EMBL für den Bau von Controllern und Halterungen für die Braille-Ventile, dem EMBL SIM für die Wartung des Mask Aligners, Bart Deplancke und Cathrin Brisken für ihr Feedback zum Manuskript und allen aktuellen und früheren Mitgliedern des Merten-Labors für Diskussionen und Feedback. BS dankt dem Premium Fellowship Program der Ungarischen Akademie der Wissenschaften (460044).

B. Szalai

Derzeitige Adresse: Turbine Simulated Cell Technologies Ltd, Budapest, Ungarn

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: L. Mathur, B. Szalai.

Abteilung für Genombiologie, Europäisches Labor für Molekularbiologie (EMBL), Heidelberg, Deutschland

Mathur L, Utharala R, Ballinger M, Landry JJM, Benes V & Merten CA

Zusammenarbeit für einen gemeinsamen Doktortitel zwischen dem EMBL und der Universität Heidelberg, Fakultät für Biowissenschaften, Heidelberg, Deutschland

L. Mathur

Abteilung für Physiologie, Medizinische Fakultät, Semmelweis-Universität, Budapest, Ungarn

B. Szalai

Institut für Enzymologie, Forschungszentrum für Naturwissenschaften, Budapest, Ungarn

B. Szalai

Institut für Bioingenieurwesen, School of Engineering, Eidgenössische Technische Hochschule (EPFL), Lausanne, Schweiz

NH You & CA Merten

Universität Straßburg, CNRS, RNA Architecture and Reactivity, UPR, 9002, Straßburg, Frankreich

M. Ryckelynck

Medizinische Fakultät und Universitätsklinikum Heidelberg, Institut für Computational Biomedicine, Universität Heidelberg, Heidelberg, Deutschland

J. Saez-Rodriguez

Medizinische Fakultät, Joint Research Centre for Computational Biomedicine (JRC-COMBINE), RWTH Aachen, Aachen, Deutschland

J. Saez-Rodriguez

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LM konzipierte und entwickelte die mikrofluidische Plattform und den Barcode-Ansatz, entwarf und führte Experimente durch und analysierte die Daten unter der Aufsicht von CAMBS. Er entwarf und führte die rechnerische Analyse der Daten unter der Aufsicht von JS-RNHD durch, entwarf und führte Experimente durch und analysierte die Daten. RU hat die LabVIEW-Software geschrieben, die für die Mikrofluidik-Plattform verwendet wird. MB führte plattenbasierte Validierungsexperimente durch. JJML verarbeitete die Sequenzierungsdaten unter der Aufsicht von VBMR und unterstützte die Entwicklung der Pikoinjektionsverfahren. LM und BS interpretierten die Ergebnisse und verfassten das Manuskript mit Hilfe von NHD, CAM und JS-R. überprüfte und redigierte das Manuskript.

Korrespondenz mit J. Saez-Rodriguez oder CA Merten.

LM, RU und CAM sind Erfinder von Patentanmeldungen, die die hier beschriebene Barcode-Strategie und mikrofluidische Methoden abdecken (WO2016207441A1). JS-R. erhielt Fördermittel von GSK und Sanofi sowie Beraterhonorare von Travere Therapeutics und Astex Pharmaceuticals. BS ist ein Vollzeitmitarbeiter von Turbine Ltd., Budapest, Ungarn. Die übrigen Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Nature Communications dankt Jeremy Jenkins, Angela Wu und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Mathur, L., Szalai, B., Du, NH et al. Combi-seq für die Multiplex-Transkriptom-basierte Profilierung von Arzneimittelkombinationen mithilfe deterministischer Barcodes in Einzelzelltröpfchen. Nat Commun 13, 4450 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-32197-0

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Eingegangen: 26. Mai 2021

Angenommen: 21. Juli 2022

Veröffentlicht: 01. August 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-32197-0

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