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Oct 27, 2023

In-situ-3D-Bioprinting mit Biobeton-Bioink

Band Nature Communications

Nature Communications Band 13, Artikelnummer: 3597 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Details zu den Metriken

In-situ-Bioprinting ist attraktiv, um den Therapie-Bioink direkt auf die defekten Organe aufzutragen und diese zu reparieren, insbesondere für Berufe wie Soldaten, Sportler und Fahrer, die im Notfall verletzt werden können. Allerdings weist herkömmliche Biotinte in ihren komplexen Betriebsumgebungen offensichtliche Einschränkungen auf. Hier entwerfen wir einen Biokonkret-Bioink mit elektrogesprühten zellbeladenen Mikrogelen als Aggregat und Gelatinemethacryloyl (GelMA)-Vorläuferlösung als Zement. Eine vielversprechende Bedruckbarkeit wird durch einen breiten Temperaturbereich gewährleistet, der von den robusten rheologischen Eigenschaften des photovernetzten Mikrogelaggregats und der Fließfähigkeit des GelMA-Zements profitiert. Verbundkomponenten passen sich gleichzeitig selbst an die Biokompatibilität und die unterschiedliche mechanische Mikroumgebung des Gewebes an. Eine starke Bindung an der Gewebe-Hydrogel-Grenzfläche wird durch Wasserstoffbrückenbindungen und Reibung erreicht, wenn der Zement photovernetzt wird. Dieser Bioink besitzt eine gute Tragbarkeit und kann bei dringenden Unfällen leicht vorbereitet werden. Mittlerweile können Mikrogele zu Minigeweben kultiviert und dann als Bioink-Aggregate gemischt werden, was darauf hindeutet, dass unser Biobeton schneller funktionalisiert werden kann als normale Bioinks. Die Ergebnisse zur Reparatur von Schädeldefekten bestätigen die Überlegenheit dieses Bioinks und sein Potenzial im klinischen Umfeld, das bei der In-situ-Behandlung erforderlich ist.

Als neu auftretende Behandlung von Organdefekten wurde das „In-situ-Bioprinting“1 ursprünglich von Campbell2 vorgeschlagen. hat in der Klinik für Aufsehen gesorgt. Kurz gesagt, Therapie-Bioink wird von chirurgischen Bioprintern entlang von Pfaden entsprechend ihrer 3D-Morphologie direkt auf die Wunden des Patienten aufgetragen3. Derzeit werden hauptsächlich ähnliche Methoden für das In-vitro-Bioprinting verwendet und bei Haut-, Knorpel- und Knochenbehandlungen eingesetzt4. Im Vergleich zur Organimplantation auf Basis von In-vitro-3D-Bioprinting bietet es aufgrund seiner In-situ-Ablagerungsfunktion weitere Vorteile (Ergänzende Anmerkung 1).

Allerdings ist das In-situ-Bioprinting rudimentär und in der klinischen Anwendung nur eingeschränkt möglich. Neben dem Mangel an zuverlässigen In-situ-Biodruckern4 liegt einer der Hauptgründe darin, dass es weniger geeignete Biotinte gibt, die ihre speziellen Anforderungen erfüllt. In bestehenden relevanten Studien ähnelt der verwendete Bioink größtenteils dem beim In-vitro-Bioprinting, nämlich der Vorläuferlösung, die keine vielversprechende Wahl für In-situ-Bioprinting darstellt. (i) In den meisten In-situ-Bioprinting-Fällen gibt es keine Bedingungen für eine strenge Kontrolle der rheologischen Eigenschaften von Bioink, insbesondere von wärmeempfindlichem Bioink. (ii) Im Gegensatz zu den Aufnahmekellern mit sauberer Oberfläche und kontrollierbarer Temperatur bei In-vitro-Bioprintern verfügt das In-situ-Bioprinting über einen speziellen Aufnahmekeller, nämlich die Wunden des Patienten mit einer konstanten Temperatur (37 °C) und Blut, wodurch das Gedruckte kollabieren kann Struktur vor der Vernetzung. (iii) Der vernetzte Bioink sollte einen niedrigen mechanischen Modul besitzen, damit eingekapselte Zellen Therapiefunktionen ausüben können. (iv) Strukturen sollten über hohe mechanische Eigenschaften verfügen, die dem Defekt entsprechen und sich selbst vor Schäden während der Reparatur schützen, was jedoch zu einem großen Widerspruch zu Anforderung (iii) führt. Der Bau von Verbundstrukturen, also das Drucken starker Gerüste und das anschließende Gießen von weichem Hydrogel, hat sich zu einer wirksamen Lösung entwickelt5,6,7,8. Ein derart komplexer Druckprozess lässt sich jedoch beim In-situ-Bioprinting nicht realisieren. (v) An der Grenzfläche zwischen defekter und gedruckter Struktur sollte eine starke Bindungskraft entstehen. (vi) In-situ-Bioink sollte tragbar und leicht für Berufe wie Soldaten, Sportler und Fahrer vorbereitet sein, die im Notfall verletzt werden können.

Mikrogele sind zu beliebten Bioprinting-Strukturen in der Zelltherapie9, der kontrollierten Arzneimittelfreisetzung10, der Krankheitsmodellierung11 usw. geworden, und es wurden viele Herstellungsmethoden vorgeschlagen12,13,14,15,16. Kürzlich wurde neben der unabhängigen Funktionseinheit in der in Nature Reviews von Burdick et al. veröffentlichten Übersicht über Mikrogele Folgendes festgestellt: 17 Im Jahr 2020 wurde die breite Anwendung des „sekundären Biodrucks“18,19,20,21 von Mikrogelen als Bioink-Komponente in der Zukunft vorhergesagt. In der neuesten Arbeit von Alge et al. 22, veröffentlicht in Science Advances im Jahr 2021, wurde eine eingehende Untersuchung zum Dissipationsprozess von Mikrogelen während des Druckens vorgestellt. Wang et al. 9 injizierte Alginat-Mikrogele zur Reparatur von Rattenorgandefekten. Burdick et al. 23,24 extrudierte gesammelte Mikrogele, um spezifische 3D-Strukturen aufzubauen. Die gesamte Forschung profitierte nicht nur von der vielversprechenden Biokompatibilität der Mikrogele, sondern auch von ihren einzigartigen rheologischen Eigenschaften ähnlich der Bingham-Flüssigkeit25,26,27, die sich unter einer bestimmten Belastung als Elastomer zeigt, bei weiterer Erhöhung der Belastung jedoch als Newton-Flüssigkeit fließt. Daher besteht das Potenzial, Biotinte auf Mikrogelbasis als völlig neue klinische In-situ-Bioprinting-Biotinte weiterzuentwickeln, um den komplizierten Anforderungen gerecht zu werden.

In dieser Arbeit entwickeln wir den Biobeton-Bioink (A–C-Bioink) für das In-situ-Bioprinting, dessen Name von Beton für den Bau abgeleitet ist und dessen Abkürzung sich aus den beiden Hauptkomponenten Aggregat (A) und Zement (C) zusammensetzt ( Abb. 1, Zusatzvideos 1 und 2). Elektrogesprühte GelMA-Mikrogele (500 μm) werden als Hauptkomponente (A) verwendet, um in komplexen Umgebungen robuste rheologische Eigenschaften ähnlich der Bingham-Flüssigkeit zu erhalten (Ergänzende Anmerkungen 3 und 4). Als Hilfskomponente (C) wird die GelMA-Vorläuferlösung (mit Photoinitiator) verwendet, um die Fließfähigkeit und Druckbarkeit sicherzustellen. Die photovernetzte Verbundstruktur besitzt eine A/C-Struktur mit niedrigem bzw. hohem mechanischem Modul, was den Widerspruch zwischen der Aufrechterhaltung der Biokompatibilität für beladene Therapiezellen und der Bewältigung der hohen Zug-/Druckspannung um den Defekt herum perfekt löst. Darüber hinaus kann die C-Komponente leicht in die Wundoberfläche eindringen und nach der Photovernetzung eine hohe innere Reibung und Wasserstoffbrückenbindungen an der Schnittstelle zwischen Defekt und Hydrogel bilden. Praktischerweise ist dieser Bioink tragbar, da die A/C-Komponente in flüssigem Stickstoff konserviert werden kann, der bei Unfällen mit Heizgeräten oder bei Körpertemperatur aufgetaut werden kann. In der Zwischenzeit können die Mikrogele vor dem Mischen zu Minigeweben kultiviert werden, was darauf hindeutet, dass unser Biokonkret-Bioink schneller funktionalisiert werden kann als herkömmliche. Die Ergebnisse der In-situ-Behandlung von Schädeldefekten bei Ratten bestätigen das zukünftige Potenzial des In-situ-Bioprintings im klinischen Umfeld.

Die oberen Tafeln zeigen die Eigenschaften des vorgeschlagenen A–C-Bioinks, der von Beton für den Bau inspiriert ist. Die unteren Felder (I-VI) zeigen die Verwendung von A–C-Bioink.

Der Substitutionsgrad (DS) von GelMA kann leicht durch Änderung der Verhältnisse von Gelatine und Methacrylsäure verändert werden. Höhere DS- und Vorläuferlösungskonzentrationen führen zu besseren mechanischen Eigenschaften der photovernetzten Strukturen28,29. Nach unserer Erfahrung weist 5 % (w/v) GelMA mit niedrigem DS (EFL-GM-30) geringe mechanische Eigenschaften und eine hohe Biokompatibilität auf. Daher wurde es für das Elektrosprühen von GelMA-Mikrogelen (A30/5, 500 μm) ausgewählt, die nachweislich sehr gleichmäßige Durchmesser besitzen (Ergänzende Anmerkung 4 und Ergänzende Abbildung 6). 20 % (w/v) GelMA mit hohem DS (EFL-GM-300) hält Druckbelastungen wie Knochengewebe stand, wohingegen 20 % (w/v) GelMA mit niedrigem DS (EFL-GM-30) Dehnungen standhalten kann Stress, wie zum Beispiel Sehnengewebe. Daher wurden sie als C-Komponente (C300/20, C30/20) ausgewählt. Zum Vergleich wurde auch 5 % (w/v) GelMA mit niedrigem DS (EFL-GM-30) als C-Komponente (C30/5) ausgewählt.

Wir gingen davon aus, dass die C-Komponente genau die Lücke in der A-Komponente infiltrierte, sodass die Mikrogele genügend innere Reibung erzeugen konnten, um einen Kollaps vor der Vernetzung zu vermeiden. Angesammeltes A30/5 (mit GFP) im Zellsieb wurde wiederholt in C30/5 (mit RFP) eingeweicht und angehoben, um das überschüssige C30/5 zu filtern (Abb. 2a). C30/5 trat spontan mit Kapillarkraft in die freie Stelle unter A30/5 ein. Der vernetzte A-C-Bioink zeigte, dass die A-Komponenten eng aneinander haften (Abb. 2b, c). Der Volumenanteil der A-Komponente wurde in den roten/grünen Bereichen mit 73,215 ± 2,312 % analysiert (Ergänzende Anmerkung 2), was der atomaren Raumnutzung in der hexagonal dichtesten Packung (HCP) in der Kristallchemie (74,05 %) ähnelte (Abb. 2d). , dass die A-Komponente unter Schwebe- und Oberflächenspannung in der flüssigen C-Komponente eine Standard-Sphäroidform aufwies und das System tendenziell die niedrigste Energie unter der Schwerkraft besaß.

eine Skizze der Benetzungsmethode im Experiment zur Volumenverhältnisanalyse. b Optische Morphologie der A-C-Verbundstruktur. c Fluoreszenzmorphologie der A-C-Verbundstruktur (Zen, Carl Zeiss, Version 8,0,0,273). d Gitter eines sechseckigen Schrankpakets in der Kristallchemie. e Die Teile des A–C-Bioink-Kits. f–k Die Vorbereitungsschritte von tragbarem A–C-Bioink. Für b und c wurde jedes Experiment unabhängig voneinander dreimal mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt.

Um den Aufbewahrungs- und Transportanforderungen gerecht zu werden, wurde eine Notfalltasche entwickelt (Abb. 2e). Eine Komponente der Ladezellen wurde in Kryokonservierungsmedium eingetaucht und in einem Gefrierröhrchen gelagert, wie zuvor von Ouyang et al. beschrieben. 30. Die C-Komponente wurde ebenfalls in einem anderen Gefrierröhrchen aufbewahrt. Die Volumenanteile der A/C-Komponente in einem Kit betrugen 74,05 % bzw. 25,95 %. Beide Gefrierröhrchen wurden in einem mit flüssigem Stickstoff gefüllten Behälter aufbewahrt.

Bei einem Unfall wurden die Gefrierröhrchen aus dem Behälter entnommen und mit einem winzigen Heizkissen bei 37 °C aufgetaut, das von einem tragbaren USB-Akku gespeist wurde (Abb. 2f). Bei sehr dringenden Unfällen ohne Heizgeräte könnten diese direkt über die Körpertemperatur erwärmt werden. Auf jeden Fall sollte die Kälteverletzung auf der Haut des Patienten bemerkt werden. Anschließend wurde das Kryokonservierungsmedium mit einer Spritze und einer Serviette entfernt. Eine Komponente wurde mit einem dünnen Löffel auf die C-Komponente übertragen und gleichmäßig gerührt. Anschließend wurde A–C-Biotinte in eine neue Spritze mit Kegeldruckdüse für In-situ-Bioprinting mit professionellen In-situ-Bioprintern oder nur mit den Händen übertragen, gefolgt von einer Photovernetzung mit 405 -nm-blaue Taschenlampe, die sich als sicher erwiesen hat und in aktuellen klinischen Szenen weit verbreitet ist, wie z. B. bei der Photohärtung von Zähnen, bei der Behandlung von Neugeborenengelbsucht mit blauem Licht usw.

In der Praxis wird das Gesamtvolumen an Bioink durch die Volumina und Mengen der verwendeten Gefrierröhrchen bestimmt. Am Ende der A–C-Bioink-Produktion kann der vorbereitete A–C-Bioink entsprechend den Produktionsanforderungen mit verschiedenen Arten von Gefrierröhrchen beladen werden. Darüber hinaus können Retter am Ende der Rettung im Hinblick auf die Menge an Gefrierröhrchen auf jeden Fall so viele Gefrierröhrchen mit A–C-Biotinte wie möglich entsprechend der Verletzungssituation des Patienten mitnehmen. Daher wäre dieses Bioink-System mit der Weiterentwicklung und Massenproduktion von A–C-Bioink für das In-situ-Bioprinting möglichst großer Gewebedefekte machbar.

A–C-Bioink sollte eine hohe rheologische Robustheit bei verschiedenen Temperaturbedingungen aufweisen, um sich an verschiedene Unfallsituationen der In-situ-Behandlung anzupassen. Es wurden A30/5–C30/20, A30/5–C300/20, A30/5–C30/5 und C bioink C30/20, C300/20, C30/5 hergestellt. Es wurden 4, 24 und 37 °C ausgewählt, bei denen sich die GelMA-Vorläuferlösung in einem übermäßigen Gelierungs-, optimierten Sol-Gel- bzw. übermäßigen Solisierungszustand für extrudierendes Bioprinting befinden würde31,32.

Die Ergebnisse des Strömungsdurchlaufs zeigten, dass sowohl A-C-Bioinks als auch C-Bioinks bei den drei ausgewählten Temperaturen Scherverdünnungseigenschaften aufwiesen (Abb. 3c), was die Grundanforderung des extrudierenden Biodrucks erfüllte. Dies lag daran, dass die GelMA-Mikrogele voneinander getrennt wurden und die Reibung zwischen ihnen bei einer hohen Schergeschwindigkeit verschwand. Darüber hinaus stimmte die Ausrichtung einzelner GelMA-Moleküle in der C-Komponente tendenziell überein und die Molekülverzwirnung wurde verringert (Abb. 3a). Laut veröffentlichten Studien9,33 hatte das System, das hauptsächlich aus Mikrogelen bestand, Bingham-Fluid-Eigenschaften. Die Flow-Sweep-Daten von A–C-Bioinks wurden wie folgt weiter an das Bingham-Flüssigkeitsmodell angepasst:

wobei \(\sigma\), \({\sigma }_{\rm {{y}}}\), \({\eta }_{{\rm {B}}}\) und \(\ dot{\gamma }\) ist Spannung, Fließspannung, Bingham-Viskosität bzw. Schergeschwindigkeit. Alle A-C-Bioinks zeigten Bingham-Flüssigkeitsmerkmale und eine lineare Beziehung zwischen Spannung und Scherrate oberhalb einer bestimmten Spannung (Abb. 3d, e). Die Streckgrenze stieg bei 4 °C aufgrund der übermäßigen Gelierung der C-Komponente, bei der GelMA-Moleküle nacheinander kollagenartige Spirochäten, Spirochätenaggregate und Aggregatnetzwerke bildeten (Abb. 3b). Das Feststoff/Flüssigkeits-Merkmal unterhalb/über der Fließspannung war auf die innere Reibung zwischen der A-Komponente bzw. die Fehlpositionierung der Mikrogele jenseits der Haftreibung zurückzuführen.

a Der Mechanismus der Strukturviskosität von A–C-Bioink. b Der Mechanismus der Sol-Gel-Übertragung der GelMA-Vorläuferlösung. c Flow-Sweep-Test. d Anpassung mit Bingham-Fluid-Modell. e Streckgrenze. (n = 3 unabhängige Experimente. Die Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt.) f Oszillationsfrequenzprüfung. g Thixotropieprüfung. h Temperaturanstiegstest des rückgeführten Vorlaufs.

Bioink sollte flüssig sein, um aus Düsen Filamente zu bilden, und feste Eigenschaften aufweisen, um die Form beizubehalten. Die Ergebnisse der Oszillationsfrequenztests zeigten, dass alle A-C-Bioinks bei unterschiedlichen Temperaturen bei niedriger bzw. hoher Frequenz ein Feststoff-/Flüssigkeitsmerkmal besaßen, was von der Bingham-Flüssigkeitseigenschaft profitierte (Abb. 3f). Bemerkenswerterweise würde herkömmlicher Einkomponenten-GelMA-Bioink in die Solisierung übergehen und kann bei Körpertemperatur (37 °C) seine Form nicht beibehalten. Selbst unter 37 °C zeigte A–C-Bioink jedoch bei niedriger Frequenz immer noch einen festen Zustand, was seine Eignung für die Ablagerung auf Wunden bestätigt. Die Thixotropie-Ergebnisse durch Hinzufügen periodisch variierender Oszillationsamplituden (200 % und 1 %) weisen darauf hin, dass die Zustandsübertragung von A-C-Bioink schnell und offensichtlich war, was die schnelle Selbstheilungsgeschwindigkeit bestätigt. (Abb. 3g)

Thermoempfindliche Bioinks benötigen Zeit, um bei einer bestimmten Temperatur einen stabilen Zustand zu erreichen. Außerdem würde bei einer bestimmten Temperatur der Sol-Gel-Zustand zu einem bestimmten Zeitpunkt vom vorherigen Zustand beeinflusst werden und während des Temperaturerhöhungs-/-senkungsprozesses völlig anders sein. Es wurden Fließtemperatur-Rampentests von A–C- und C-Bioink durchgeführt, um die Viskositätsschwankung bei wiederholt steigenden/abfallenden Temperaturen (4–39 °C, 5 °C/min) dreimal (I–III) zu untersuchen (Abb. 3h). ). Die Ergebnisse zeigten, dass selbst die Viskositätskurven des Temperaturerhöhungs-/-absenkungsprozesses desselben Bioinks nicht überlagert waren, was eine schlechte Zustandsumkehr und Stabilität des thermoempfindlichen Bioinks belegt. Im Vergleich zu C-Bioink überlagerten sich die von den Viskositätskurven umgebenen Zonen in den kontinuierlichen drei Tests von A–C-Bioink jedoch nahezu, was darauf hindeutet, dass A–C-Bioink den Effekt des vorherigen Zustands effektiv vermeiden konnte. Darüber hinaus dehnte sich die Viskosität von C-Bioink bei einem so großen Temperaturänderungsbereich um 4–5 Größenordnungen aus, während die von A–C-Bioink aufgrund der dominanten Rolle von Mikrogelen innerhalb einer Größenordnung blieb. Bemerkenswerterweise waren vielversprechende Bioprinting-Temperaturen von 20–24 °C auch der Bereich, in dem sich die Viskosität dramatisch änderte. Man kann sich vorstellen, dass, sobald während des In-situ-Biodrucks eine geringfügige Temperaturschwankung in diesem Bereich auftritt, die Viskosität von herkömmlichem Bioink stark schwankt und unvorhersehbare Risiken mit sich bringt, während A–C-Bioink die Viskositätsstabilität in hohem Maße perfekt aufrechterhalten und garantieren kann die Gültigkeit der Behandlung.

Es wurde eine simulierte In-situ-Bioprinting-Szene erstellt, um die Druckbarkeit von A–C-Bioink aus dem Extrusions- und Ablagerungszustand zu bewerten. Für den Extrusionszustand wurden drei Umgebungstemperaturen (4, 24, 37 °C) sowie A30/5–C300/20 und C300/20 ausgewählt und mit einer konstanten Durchflussrate extrudiert. (Abb. 4a). Bei 37 °C befand sich C-Bioink in einem übermäßigen Solisierungszustand und bildete Tröpfchen. Bei 4 °C befand sich C-Bioink in einem übermäßigen Gelierungszustand und hatte sich in der Spritze zu einer Hydrogelmasse entwickelt, die zeitweise Fragmente bildete. C-Bioink zeigte nur bei 24 °C eine gute Druckbarkeit und bildete gleichmäßige Filamente. Allerdings konnte A–C-Bioink dank seiner großen rheologischen Robustheit bei den drei Temperaturen gleichmäßige Filamente bilden. Für den Abscheidungszustand wurde die Umgebungstemperatur auf 24 °C eingestellt, um den besten Extrusionszustand zu erreichen. Um die Wunden der Patienten zu simulieren, wurde die Aufnahmeplattform auf 37 °C (Körpertemperatur) eingestellt und mit etwas Lebensmittelfarblösung (Blut) bestrichen (Abb. 4b). Der abgelagerte A–C-Bioink konnte die 3D-Struktur perfekt aufrechterhalten, während C-Bioink nach und nach schmolz und sich mit dem „Blut“ vermischte. Daher würde sich A–C-Bioink hervorragend an die komplexen Bedingungen rund um Wunden anpassen. Darüber hinaus wurde A–C-Bioink erfolgreich mit einem kommerziellen 3D-Biodrucker gedruckt, um einen 3D-Würfel mit 12 Schichten und 7,5 mm Höhe in der grob kontrollierten Umgebungstemperatur (30 °C) und auf dem „Wund“-Aufnahmegrund zu erstellen. (Abb. 4c, Ergänzende Anmerkungen 5, 9 und ergänzendes Video 3).

a Das extrudierte Filament formt sich bei unterschiedlichen Temperaturen. b Formerhaltend bei mit „Blut“ gefüllter „Wunde“ bei 37 °C. c 3D-Druck eines Würfels an einer mit „Blut“ gefüllten „Wunde“ bei 37 °C mit A–C-Bioink. d Mechanismus der Bildung einer stabilen Bindungskraft. e Innere Reibung an der Schnittstelle. f Wasserstoffbrückenbindungen zwischen Aminogruppen auf Gewebe und photogenerierten Aldehydgruppen auf GelMA. g Zugbindungstest mit A–C-Bioink und Schweinesehne. h Bindungsbelastungstest von A30/5–C30/20 mit Schweinesehne. i Druckbindungstest mit A–C-Bioink und Schweinerippe. j Bindungsstresstest von A30/5–C300/20 mit Schweinerippe.

Beim In-vitro-Bioprinting werden 3D-Strukturen auf der Ablagerungsplattform vernetzt, was dazu führt, dass nach der Transplantation keine starke Bindungskraft mit Gewebe besteht. Während der Therapie kann die Verschiebung der transplantierten Strukturen für den Patienten ungültig oder gefährlich sein. Im Gegensatz dazu würde in situ abgeschiedener A-C-Bioink eine starke Bindungskraft an der Grenzfläche zwischen Defekt und Hydrogel erzeugen (Abb. 4d). Dies liegt daran, dass die C-Komponente nach Kontakt mit der Körpertemperatur fließfähig sein und leicht in die Defektstelle eindringen kann, wodurch die Bindungsstellen an der Grenzfläche und die innere Reibung erhöht werden (Abb. 4e). Darüber hinaus können A-C-Verbundstrukturen aufgrund der besonderen chemischen Eigenschaften von GelMA eine zusätzliche Grenzflächenkraft auf die Wunde aufbauen, was wahrscheinlich auf die Bindung photogenerierter Aldehydgruppen an die Aminogruppen auf der Gewebeoberfläche zurückzuführen ist34 (Abb. 4f). Um die starke Bindungskraft deutlich zu beobachten, wurde A30/5–C30/20-Bioink auf frische Schweinesehnen gegossen (Abb. 4g), während A30/5–C300/20-Bioink auf frische Schweinerippen gegossen wurde (Abb. 4i). Den A-C-Strukturen wurden Kräfte in alle Richtungen hinzugefügt (Zusatzvideo 4). A–C-Strukturen, die fest mit der Gewebeoberfläche verbunden sind. Um die Bindungskraft zwischen A–C-Bioink und Gewebeoberfläche zu untersuchen, wurden A30/5–C30/20 und A30/5–C300/20 gegossen (ca. 2 mm hoch) und zwischen zwei Stücken frischer Schweinesehne (Querschnitt) photovernetzt war etwa 3 cm × 1 cm groß) und zwei Stücke frische Schweinerippen (Querschnitt war etwa ⌀1,6 cm). Die Bindungsspannung wurde mit der Methode der Dehnung der Gewebe-Hydrogel-Gewebe-Struktur getestet, indem zwei Gewebestücke in entgegengesetzter Richtung mit 1 mm/min abgeschnitten wurden. Die Bindungsspannung zwischen A30/5–C30/20 und der Schweinesehne könnte über 4000 Pa erreichen (Abb. 4h) und die zwischen A30/5–C300/20 und der Schweinerippe könnte fast 6000 Pa erreichen (Abb. 4j). Bei A30/5–C300/20 und der Rippenkurve traten zwei Stufen auf, da A30/5–C300/20 besser zum Komprimieren geeignet war und während des Strecktests Risse bilden würde. Alle Ergebnisse zeigten, dass A–C-Bioink die Anforderung einer starken Bindungskraft erfüllen würde.

Im Vergleich zur herkömmlichen Methode zum Aufbau von Verbundstrukturen, nämlich dem Drucken von Verstärkungsgerüsten und dem anschließenden Gießen von weichem Hydrogel, weist die auf A–C-Bioink basierende Methode offensichtliche Überlegenheit auf. Erstens kann das Strukturdesign flexibler sein und ein stärkeres Gerüstnetzwerk würde sich spontan um eine Komponente herum bilden. Da es sich bei den A/C-Komponenten außerdem um GelMA mit Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindungen handelt, würden während der Photovernetzung die nicht umgesetzten Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindungen auf der Oberfläche der GelMA-Mikrogele beim Elektrosprühen aufbrechen und sich mit den gebrochenen Bindungen in der C-Komponente verbinden, wodurch starke Bindungen entstehen kovalente Bindungen an der A/C-Schnittstelle (Abb. 5a), die bei herkömmlichen Methoden fehlen.

a Mechanismus des Prozesses zur Bildung stabiler kovalenter Bindungen der A-C-Verbundstruktur. b Zugversuchskurve. c Spannungszustand verschiedener Biotinten. d Druckprüfkurve. e Kompressionszustand verschiedener Biotinten. f Simulationsmodelle der Zug-/Druck-A-C-Verbundstruktur und Elementarzelle. g Drucksimulation einer A-C-Verbundstruktur. h Zugsimulation einer A-C-Verbundstruktur.

Die Druckeigenschaften von A30/5–C300/20, C300/20, A30/5–C30/5, C30/5 und die Zugeigenschaften von A30/5–C30/20, C30/20, A30/5–C30/5 , C30/5 wurden getestet. Der Druckmodul betrug 204,00, 2608,00, 16,26 bzw. 3,73 kPa (Abb. 5b) und der Young-Modul betrug 1,81, 11,98, 0,80 bzw. 1,26 kPa (Abb. 5d), was darauf hindeutet, dass die C-Komponente offensichtlich die mechanischen Eigenschaften verstärkte der gedruckten Struktur, was auch durch die visuelle Beobachtung nachgewiesen wurde (Abb. 5c–e).

Die Spannungsverteilung innerhalb der A-C-Verbundstruktur wurde mit einer Finite-Elemente-Simulation analysiert. Die Struktur wurde als HCP-Modell vereinfacht (Abb. 5f). Die Verschiebungsrandbedingung im Zug-/Druckmodell wurde auf 50 % bzw. 10 % festgelegt (Abb. 5g, h). Im Vergleich zur C-Struktur verteilt sich eine hohe Von-Mises-Spannung auf die Mikrogele in der A-C-Verbundstruktur, genau wie ein starkes Gerüst, das im Inneren „gedruckt“ ist, was es ermöglichte, der extrazellulären Matrix (ECM) eine ähnliche mechanische Umgebung in verschiedenen A-C-Strukturen bereitzustellen Bioink-Typen. In Analogie zur Elementarzellen-Forschungsmethode in der Kristallchemie haben wir das Konzept der „A–C-Elementarzelle“ mit der gleichen Einschnittmethode wie HCP innovativ entwickelt und ein regelmäßiges Netzwerk mit hoher Spannung dargestellt, das die Mikrogele mit niedriger Spannung in beiden unter Druck verpackt /Zugmodelle.

A30/5-einkapselnde Knochenmarksstromazellen (BMSCs) wurden elektrogesprüht und kultiviert, um weiter als funktionelle Zelltherapieeinheiten in A–C-Bioink verwendet zu werden. Die Zelllebensfähigkeit am 1., 4. und 7. Tag lag mit dem LIVE/DEAD-Kit bei über 90 % (Abb. 6a), was auf die grundlegende Biokompatibilität von A30/5 hinweist, und die F-Actin-Morphologie zeigte, dass sich BMSCs allmählich im Inneren ausbreiten konnten 3D-Mikroumgebung (Abb. 6b). Darüber hinaus wurden einige A30/5-einkapselnde BMSCs nach dreitägiger Grundkultivierung in osteogenem Induktionsmedium kultiviert. Am 7. Tag der Induktion wurde A30/5 mit alkalischer Phosphatase (ALP) angefärbt und zeigte, dass die induzierten BMSCs in das frühe osteogene Stadium eingetreten waren (Abb. 6c). Am 21. Tag der Induktion wurde A30/5 mit Alizarin Red S (ARS) angefärbt und zeigte, dass die induzierten BMSCs in das späte osteogene Stadium eingetreten waren und Kalziumknötchen innerhalb von A30/5 erzeugten (Abb. 6d), was dies bestätigte osteogene Differenzierungsfähigkeit und mögliche Therapiewirkung. Darüber hinaus würde A30/5 mit BMSCs während des In-situ-Drucks einer Scherkraft von der Druckdüse ausgesetzt sein, was zu Zellapoptose führen könnte. Aus den Ergebnissen der Apoptosetests mit Durchflusszytometrie (Abb. 6e) ging hervor, dass durch Extrusion verursachte Apoptose nicht offensichtlich war. Dies zeigt, dass die von A30/5 gebildete weiche Umgebung die eingekapselten BMSCs vor Scherkräften während der Extrusion schützen und die biologische Funktion gewährleisten kann.

a Lebensfähigkeit der in GelMA-Mikrogelen eingekapselten BMSCs. b Aktinmorphologie der in GelMA-Mikrogelen eingekapselten BMSCs. c ALP-Test der osteogen induzierten BMSCs-beladenen A-Komponente. d ARS-Test der osteogen induzierten BMSCs-beladenen A-Komponente. e Apoptosetest mit Annexin V-FITC/PI mittels Durchflusszytometrie. Für a–d wurde jedes Experiment unabhängig voneinander dreimal mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt.

Um die therapeutische Wirkung von A–C-Bioink zu untersuchen, wurde A30/5–C300/20-Bioink mit oder ohne BMSCs direkt im Schädeldefekt der Ratte abgelagert (Säule: Durchmesser 5 mm und Höhe 1,5 mm) und photovernetzt (Abb. 7a). In der zweiten Woche zeigte die Mikrocomputertomographie die Bildung neuer Knochen in der BMSC-beladenen A–C-Gruppe (Abb. 7c). Allerdings bildete sich in der Blindgruppe kein offensichtlicher neuer Knochen, und in der Gruppe ohne BMSC-Belastung zeigte sich nur ein sehr begrenztes Maß an Knochenregeneration. Dies lag wahrscheinlich daran, dass Hydrogele als Gerüst für relevante Zellen an der ursprünglichen Defektstelle fungierten und mehr Wachstumsraum boten. Darüber hinaus zeigte die mit BMSC beladene A–C-Gruppe eine bessere Wirksamkeit der Knochenregeneration mit einem höheren BV/TV (Abb. 7b). In der 4. Woche überdeckte der Knochen die verletzte Stelle in der mit BMSC-belasteten A–C-Gruppe fast vollständig, und in der mit BMSC-belasteten Gruppe zeigte sich auch mehr neues Knochengewebewachstum. Die BV/TV-Werte stiegen mit der Zeit in allen Gruppen an und sowohl die mit BMSC beladenen als auch die BMSC-entladenen Gruppen waren signifikant höher als die der Blindgruppe. In Übereinstimmung mit der Röntgenuntersuchung ergab die histologische Analyse mit Hämatoxylin und Eosin (Abb. 7d) und die Masson-Trichrom-Färbung (Abb. 7e) in der zweiten Woche eine Knochenneubildung mit der größten Oberfläche in der BMSC-beladenen Gruppenprobe und keine ausgeprägte Knochenbildung in leeren und BMSC-entladenen Gruppen. In der 4. Woche nahm die Knochenbildung in allen Gruppen zu. Histologische Beobachtungen bei höheren Vergrößerungen bestätigten, dass der neugebildete Knochen mit typischer Struktur in der BMSC-beladenen Gruppe viel mehr Regionen mit neuer reifer Knochenbildung aufwies als die anderen Gruppen, was darauf hindeutet, dass BMSC-beladener A–C-Bioink die endogene Knochenbildung in einem kritischen Zustand fördern könnte -Modell eines Rattenschädeldefekts in Größe.

a Implantation und Photovernetzung von A–C-Bioink am Schädeldefektmodell der Ratte. b BV/TV-Wert. (n = 5 Ratten. Die Daten werden als Mittelwert ± SD mit GraphPad Prism 8 dargestellt.) Es wurde eine zweiseitige Zwei-Wege-ANOVA gefolgt von einem Tukey-Post-hoc-Mehrfachvergleichstest verwendet. Und der statistische Test wurde innerhalb der 2w-Gruppen bzw. 4w-Gruppen durchgeführt, jedoch nicht zwischen den 2w- und 4w-Gruppen. c Mikro-Computertomographie-Untersuchung. d Histologische Analyse mit H&E-Färbung. e Histologische Analyse mit Masson-Trichrom-Färbung. Für d, e wurde jedes Experiment unabhängig dreimal mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt.

Die tatsächlichen klinischen Fälle von Organdefekten werden durch alle Arten von Unfällen verursacht, wie z. B. Brände, Verkehrsunfälle und militärische Verletzungen. Daher sind die 3D-Morphologien und Größen der Organdefekte sehr unterschiedlich. Um die In-situ-Bioprinting-Fähigkeit von A–C-Bioink in einer klinischen Umgebung zu untersuchen, wurden vier Ratten-„Patienten“ mit Schädeldefekten mit annähernd rechteckiger, quadratischer, trapezförmiger und dreieckiger Form (1,5 mm Höhe) mit einem Zahntrepan erzeugt (Abb. 8a–c). Als In-situ-Bioprinting-Werkzeug wurde das Roboterarmsystem ausgewählt (Abb. 8b). Vier Ratten-„Patienten“ wurden auf den Operationstisch gelegt. Die 3D-Modelle der Defekte wurden mit computergestützter Designsoftware neu erstellt, und das Druckroutineprogramm wurde mit Slicing-Software generiert und in das Steuerungssystem des Roboterarms geladen. Mit A30/5–C300/20-Bioink verkapselte BMSCs wurden in situ in den Schädeldefekt von vier „Patienten“ eingebracht und mit 405-nm-Blaulicht photovernetzt (Ergänzungsvideo 5). Nach 6 Wochen Implantation zeigte die Mikrocomputertomographie, dass sich bei allen „Patienten“ neuer Knochen vom Rand zum Zentrum der Defekte gebildet hatte (Abb. 8d, e), was die hohe Durchführbarkeit von A–C-Bioink in in bestätigte -Situ-Bioprinting-Therapie.

eine 3D-Strukturmorphologie der Schädeldefektmodelle der Ratte. b In-situ-Bioprinting-Schritte mit A–C-Bioink. c Ursprüngliche Schädeldefektmorphologie des „Patienten“. d Mikrocomputertomographische Untersuchung nach 6-wöchiger In-situ-Behandlung. e BV/TV-Wert nach 6-wöchiger In-situ-Behandlung.

In den meisten aktuellen Studien zu Mikrogel-basiertem Bioink werden in vitro/vivo gesammelte Mikrogele nur abgelagert, um 3D-Strukturen zu bilden, die bei den täglichen Aktivitäten der Patienten kollabieren oder subkutan aus der Wundstelle herausgedrückt werden können. Währenddessen wurden die hervorragenden Eigenschaften und die Revolution von Biotinte auf Mikrogelbasis beim In-situ-Bioprinting ignoriert. Der hier vorgeschlagene Biobeton-Bioink enthielt eine bedarfsgerechte Zementkomponente, nämlich eine andere Hydrogel-Vorläuferlösung im Bioink-System, und die Wechselwirkung zwischen dem Aggregat und der Zementkomponente löste erfolgreich die Probleme, die bei der Entwicklung klinischer In-situ-Anwendungen eingeschränkt waren Bioprinting. Durch die Kombination der vielversprechenden rheologischen Eigenschaften von Mikrogelen und der mechanischen Einstellbarkeit von GelMA zeigte A–C-Bioink eine gute Robustheit beim In-situ-Druck, eine einfache Bildung der Verbundstruktur, eine therapeutische In-vivo-Wirkung, eine Bindungskraft an der Gewebe/Hydrogel-Grenzfläche und eine gute Tragbarkeit.

Bisher wurden immer mehr Herstellungsmethoden für funktionelle Mikrogewebe vorgeschlagen. Darüber hinaus kann die zellbeladene A-Komponente leicht mit einem spezifischen Induktionsmedium vorinduziert und in flüssigem Stickstoff gelagert werden, um eine bessere Tragbarkeit und therapeutische Wirkung zu erzielen, wodurch die Massenproduktion und der Transport von A–C-Biotinte möglich werden, um den klinischen Anforderungen gerecht zu werden . Wir glauben, dass A–C-Bioink eine wichtige Rolle bei der Behandlung von Organdefekten spielen und einen großen Vorstoß bei der Entwicklung der klinischen In-situ-Bioprinting-Technologie leisten wird.

In Zukunft kann A–C-Bioink auf mehr Arten gestaltet werden. Für die A-Komponente können die Zellarten in der A-Komponente für weitere Funktionen geändert werden (Ergänzende Anmerkung 7). Darüber hinaus wurden in unserer vorherigen Studie35 hierarchische Mikrogele hergestellt, mit denen synergistische Behandlungswirkungen realisiert werden konnten. Für die C-Komponente ist GelMA das einzige Biomaterial, das hier verwendet wird, und andere Biomaterialien könnten als Ersatz dienen, wie beispielsweise Hyaluronsäuremethacryloyl (HAMA) mit hoher mechanischer Einstellbarkeit36,37,38,39,40. Darüber hinaus haben wir bei der Erkundung herausgefunden, dass die A-Komponente, die Endothelzellen einkapselt, durch die C-Komponente, die Tumorzellen einkapselt, die den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF) absondern, vaskularisiert werden kann (Ergänzende Anmerkung 8), was wahrscheinlich eine In-situ-Vaskularisierung bei Organdefekten bewirken würde. Darüber hinaus ist das Problem der Nährstoff-/Gasversorgung in großflächigen Hydrogelstrukturen ein häufiges Problem sowohl beim In-situ-Bioprinting als auch beim In-vitro-Bioprinting. Glücklicherweise haben Forscher in unserem Labor43 oder anderen Laboren44 eine Reihe effektiver Möglichkeiten zur Lösung dieses Problems vorgeschlagen. Daher könnte der A-C-Bioink der nächsten Generation in Zukunft so konzipiert werden, dass eine geopferte Komponente oder eine Phasentrennungskomponente verwendet wird, um ein stärkeres Nährstoffnetzwerk in der A-C-Struktur zu bilden.

In Anbetracht der Portabilität und Multiszenen-Machbarkeit fordern wir in Zukunft die Entwicklung intelligenter und tragbarer Geräte für das In-situ-Bioprinting von A–C-Bioinks. Als Annahme könnte eine zusammengesetzte Flasche mit integriertem Heizgerät, tragbarer Batterie und Taschenlampe entworfen werden. Darüber hinaus können aus städtebaulicher Sicht „Stickstoffstationen“ wie Tankstellen und „gemeinsam genutzte tragbare In-situ-Biodrucker“ wie gemeinsam genutzte Fahrräder an öffentlichen Orten als soziale Dienstleistung eingerichtet werden, so dass die langfristige Speicherung von A–C-Bioink in Lange Transportwege und die Unmittelbarkeit des In-situ-Bioprintings können gewährleistet werden.

Eine reine 5 %ige (Gew./Vol.) GelMA-Präpolymerlösung wurde durch Auflösen des gefriergetrockneten GelMA (EFL-GM-30, Reinheit > 99,9 %) und Lithiumphenyl-2, 4, 6-trimethylbenzoylphosphinat (LAP, 0,5 % (Gew.)) hergestellt /v), Reinheit > 99,8 % in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Die Lösung wurde durch einen 0,22-μm-Filter filtriert. Mit der Metalldüse (30 G) und dem Metallring wurde ein elektrisches Feld erzeugt. Die Durchflussrate der Elektrospray-Tinte wurde auf 50 μl/min eingestellt und von einer Injektionspumpe angetrieben. Die Spannung wurde auf 2,86 kV eingestellt. Die Umgebungstemperatur wurde auf 30 °C eingestellt, um die geeignete Fließfähigkeit der Elektrospray-Tinte sicherzustellen. Die elektrogesprühten Mikrotröpfchen wurden von einer mit Silikonöl gefüllten Petrischale aufgenommen und durch blaues Licht von 405 nm vernetzt. Die vernetzten GelMA-Mikrogele wurden in ein Zentrifugenröhrchen überführt und 5 Minuten lang (dreimal) bei 128,57 × g zentrifugiert, um das Silikonöl zu entfernen. Die Mikrogele wurden in PBS gelagert. Für die BMSC-beladenen GelMA-Mikrogele wurden BMSCs in der Elektrospray-Tinte mit einer Zelldichte von 5 × 105 Zellen/ml gemischt. Die vorbereiteten BMSC-beladenen GelMA-Mikrogele wurden in DMEM/F-12-Komplettmedium, ergänzt mit 10 % (v/v) fötalem Rinderserum (FBS), bei 37 °C und 5 % CO2 kultiviert.

Eine reine GelMA-Präpolymerlösung wurde durch Auflösen des gefriergetrockneten GelMA (EFL-GM-30/EFL-GM-300, Reinheit > 99,9 %) und Lithiumphenyl-2, 4, 6-trimethylbenzoylphosphinat (LAP, 0,5 % (w/m) hergestellt. v)) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Die Lösung wurde durch einen 0,22-μm-Filter filtriert.

Für die rheologische Prüfung von A–C-Bioink wurde ein 25-mm-Parallelplattenrotor ausgewählt und der Testraum auf 2,5 mm eingestellt (ungefähr das Fünffache des Durchmessers der A-Komponente). Für die rheologische Prüfung von C-Bioink wurden ein 25-mm-Parallelplattenrotor und ein 1-mm-Testraum für den 4-°C-Test und ein 50-mm-Parallelplattenrotor und ein 0,5-mm-Testraum für den 24- und 37-°C-Test eingestellt C-Tests. Für den Flow-Sweep-Test wurde der Schergeschwindigkeitsbereich auf 0,1–100 s−1 eingestellt. Die Datenanpassung mit dem Bingham-Fluidmodell wurde mit MATLAB durchgeführt. Für die Prüfung der Schwingungsfrequenz wurde die Amplitude auf 1 % und der Frequenzbereich auf 1000–0,1 rad/s eingestellt. Zur Thixotropieprüfung wurde den Proben die periodisch veränderte Schwingungsamplitude (200 % und 1 %) zugesetzt. Die Wechselperiode wurde auf 30 s festgelegt und in jeder Stufe wurden fünf Punkte untersucht und dreimal wiederholt. Für den Anstiegstest der Fließtemperatur wurde der Bioink dreimal hin und her gekühlt/erhitzt. Die Temperaturänderungsrate wurde auf 5 °C/min eingestellt.

Für die Druckproben wurde Biotinte A30/5–C300/20, C300/20, A30/5-C30/5 und C30/5 in die zylindrische Form (φ9 mm × 6,3 mm) gegossen und mit 405-nm-Blau vernetzt Licht. Für die Zugproben wurde Biotinte A30/5–C30/20, C30/20, A30/5–C30/5 und C30/5 in die quaderförmige Form (20 mm × 3 mm × 5 mm) gegossen. Die mechanischen Tests wurden auf einer Hydrogel-Probentestmaschine durchgeführt. Die Bewegungsgeschwindigkeit wurde auf 1 mm/min eingestellt. Die mechanische Simulation wurde mit COMSOL Multiphysics durchgeführt. Die Poisson-Verhältnisse der C30/20- und C30/5-Strukturen wurden auf 0,034 bzw. 0,031 festgelegt. Die Verschiebungsrandbedingung in der Zugsimulation wurde auf 50 % der ursprünglichen Länge des Modells festgelegt. Die Poisson-Verhältnisse der C300/20- und C30/5-Strukturen wurden auf 0,218 bzw. 0,031 festgelegt. Die Verschiebungsrandbedingung in der Drucksimulation wurde auf 10 % der ursprünglichen Länge des Modells festgelegt.

BMSCs (Primärzellen von Ratten) wurden vom Stomatology Hospital, School of Stomatology, Zhejiang University School of Medicine, Zhejiang Provincial Clinical Research Center for Oral Diseases, Key Laboratory of Oral Biomedical Research of Zhejiang Province, Cancer Center of Zhejiang University, Hangzhou 310006, bereitgestellt Die elektrogesprühten BMSC-beladenen GelMA-Mikrogele wurden in DMEM/F-12-Komplettmedium kultiviert. Die Lebensfähigkeit der BMSC wurde nach 1, 4 und 7 Tagen gemessen. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde mit dem Live/Dead-Assay 40 Minuten lang getestet. Anschließend wurde CLSM angewendet, um die eingekapselten BMSCs abzubilden, indem von jedem Einzelbild zwei Bilder aufgenommen wurden: grün für lebende Zellen und rot für tote Zellen. Die Anzahl lebender und toter Zellen wurde mit ImageJ analysiert und die BMSC-Lebensfähigkeit als Verhältnis der Anzahl lebender Zellen zur Gesamtzahl der Zellen berechnet. Für die Morphologie der eingekapselten BMSCs wurden sie mit einem Zytoskelettfarbstoff, einschließlich Aktin, gefärbt, der mit TRIC-Phalloidin (40734ES75, Yeasen Biotechnology) gefärbt wurde, und der Kern wurde mit DAPI gefärbt. Die BMSC-beladene A-Komponente wurde mit CLSM abgebildet.

Die elektrogesprühten BMSC-beladenen GelMA-Mikrogele wurden 3 Tage lang in DMEM/F-12-Komplettmedium kultiviert. Anschließend wurde das osteogene DMEM/F-12-Induktionsmedium mit Dexamethason (0,1 mM), β-Glycerinphosphat-Dinatriumsalzhydrat (10 mM) und L-Ascorbinsäure (50 μg/ml) hergestellt. Die BMSC-beladenen GelMA-Mikrogele wurden mit dem vorbereiteten Induktionsmedium induziert. Am 7. Tag wurde die BMSC-beladene A-Komponente 30 Minuten lang mit 4 % (Gew./Vol.) Polyformaldehyd fixiert und mit alkalischer Phosphatase (ALP) angefärbt. Am 21. Tag wurde die BMSC-beladene A-Komponente 30 Minuten lang mit 4 % (Gew./Vol.) Polyformaldehyd fixiert und mit Alizarin Red S angefärbt. Die gefärbten Proben wurden mit einem optischen Mikroskop beobachtet.

Die A30/5 mit BMSCs wurden wie oben elektrogesprüht, wobei die Hälfte davon aus einer kegelförmigen 20-G-Düse mit 150 μl/min extrudiert wurde. Nach 4-stündiger Kultivierung wurde das extrudierte und nicht extrudierte A30/5 mit BMSCs mit 20 U/ml Kollagenase II PBS-Lösung für 30 Minuten (37 °C) abgebaut, um GelMA-Hydrogel zu entfernen. Die geernteten Zellen wurden mit Annexin V-FITC/PI-Kits gefärbt und jeweils durchflusszytometrisch getestet. Die Daten wurden mit der FlowJo-Software analysiert.

Dreißig 12 Wochen alte männliche SD-Ratten (250–300 g) wurden vom Tierversuchszentrum der Zhejiang-Universität (Hangzhou, China) zur Verfügung gestellt. Die Experimente wurden von der Ethikkommission für Tierforschung der Universität Zhejiang genehmigt (Ethikgenehmigungsnummer: ZJU20210172) und in Übereinstimmung mit der Kommission für institutionelle Tierpflege und -nutzung der Universität Zhejiang durchgeführt. Die SD-Ratten wurden nach dem Zufallsprinzip in Gruppen eingeteilt, darunter leere, leere Beton- und induzierte Beton-Hydrogel-Mikrokügelchen, um das osteogene Potenzial in einem Schädeldefekt bei der Implantation von Hydrogel-Mikrokügelchen zu bewerten. SD-Ratten wurden mit einer intraperitonealen Injektion von 2 % Pentobarbital-Natrium anästhesiert. Nach vollständiger Rasur und Desinfektion wurde in der Mitte des Operationsbereichs ein Längsschnitt vorgenommen und anschließend das Weichgewebe vorsichtig abgetrennt, um die Schädeldecke freizulegen. Das Periost wurde entfernt und zwei bilaterale Defekte mit einem Durchmesser von 5 mm wurden mit einem Zahntrepan erzeugt. Anschließend wurden die Hydrogel-Mikrokügelchen in die Defekte implantiert. Drei Tage lang wurde postoperativ einmal täglich Penicillin injiziert.

Nach 2 und 4 Wochen Implantation wurden die Ratten (n = 5 in jeder Gruppe) durch CO2-Erstickung eingeschläfert, und die Kalvarienprobe wurde geerntet und zur weiteren Charakterisierung in 4 % (Gew./Vol.) Paraformaldehyd fixiert. Die dreidimensionalen (3D) Strukturen des regenerierten Knochengewebes im Schädeldefektbereich wurden mit Mikro-CT (SkyScan, SkyScan 1176, Belgien) mit folgenden Scanparametern ausgewertet: Auflösung 18 μm, Spannung 65 kV, Strom von 385 μA und A1-Filter von 0,5 mm. Die 3D-Rekonstruktion wurde mit Systemsoftware (SkyScan, Belgien) durchgeführt. Das Verhältnis von Knochenvolumen zu Gewebevolumen (BV/TV) wurde mit einem Zylinder-ROI von 5 mm Durchmesser quantitativ bestimmt.

Nach 2 und 4 Wochen Implantation wurden die geernteten Proben 48 Stunden lang in 4 % (Gew./Vol.) Paraformaldehyd fixiert und 2 Wochen lang in 15 % Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)-Lösung bei Raumtemperatur entkalkt. Die EDTA-Lösung wurde alle 3 Tage erneuert. Anschließend wurden die Proben durch eine abgestufte Alkoholreihe dehydriert und in Paraffin eingebettet. Aus der Mitte der eingebetteten Proben wurden histologische Schnitte mit einer Dicke von etwa 5 μm angefertigt, gefolgt von einer Hämatoxylin- und Eosin- (H&E) oder Masson-Trichrom-Färbung zur Beurteilung der Knochenbildung. Die Bilder wurden unter einem Hellfeldmikroskop (Olympus, Tokio, Japan) aufgenommen.

Die unterschiedlichen Schädeldefektmorphologien wurden mit einem Zahntrepan (5 mm Durchmesser, 1,5 mm Höhe) erstellt. Die Defektmorphologien der „Patienten“ I, II und III waren rechteckig, quadratisch bzw. trapezförmig mit 2, 4 und 5 Kreisen und der Mittenabstand betrug 1 mm. Die Defektmorphologie von „Patient“ IV war dreieckig mit 3 Kreisen und der Mittenabstand betrug 4 mm. Die Defektmodelle wurden in Solidworks neu erstellt und mit Repetier-Software in Scheiben geschnitten, um die Pfadinformationen zu erhalten, gefolgt von der Übertragung an das entsprechende Steuerungsprogramm, das die Steuerungssoftware des Roboterarmsystems nutzte. Die Bioink-Durchflussrate wurde auf 150 μl/min und die Düsenbewegungsgeschwindigkeit auf 120 mm/min eingestellt. Als Druckdüse wurde die kegelförmige 20G-Düse ausgewählt. Der ursprüngliche X-Y-Punkt der Düse wurde entsprechend der hinteren rechten Kante des Schädeldefekts festgelegt, und der ursprüngliche Z-Punkt wurde entsprechend dem höchsten Punkt des Schädels um den Defekt herum festgelegt. Die Injektionspumpe wurde am Ende des Roboterarmsystems befestigt. Nach dem A–C-Bioink-Druck wurde der abgeschiedene Bioink mit 405-nm-Blaulicht 30 Sekunden lang vernetzt, und die Kopfhaut wurde genäht und sterilisiert.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Die Autoren erklären, dass alle Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, in der Arbeit und ihren ergänzenden Informationen oder auf Anfrage bei den entsprechenden Autoren erhältlich sind.

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Referenzen herunterladen

Diese Studie wurde vom National Key Research and Development Program of China (2018YFA0703000, YH), der National Natural Science Foundation of China (Nr. U1909218, YH) und dem Science Fund for Creative Research Groups der National Natural Science Foundation of China gesponsert (Nr. T2121004, YH).

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Mingjun Xie, Yang Shi.

Staatliches Schlüssellabor für Fluidtechnik und mechatronische Systeme, Fakultät für Maschinenbau, Zhejiang-Universität, 310027, Hangzhou, China

Mingjun Xie, Jingbo Zhang, Zichen Chen, Jianzhong Fu und Yong He

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Mingjun Xie, Jingbo Zhang, Zichen Chen, Jianzhong Fu und Yong He

Stomatologisches Krankenhaus, Fakultät für Stomatologie, Medizinische Fakultät der Zhejiang-Universität, 310006, Hangzhou, China

Yang Shi, Chun Zhang, Mingjie Ge und Zhijian Xie

Klinisches Forschungszentrum der Provinz Zhejiang für orale Erkrankungen, 310006, Hangzhou, China

Yang Shi, Chun Zhang, Mingjie Ge und Zhijian Xie

Schlüssellabor für orale biomedizinische Forschung der Provinz Zhejiang, 310006, Hangzhou, China

Yang Shi, Chun Zhang, Mingjie Ge und Zhijian Xie

Krebszentrum, Zhejiang-Universität, 310058, Hangzhou, Zhejiang, China

Yong He

Schlüssellabor für Materialverarbeitung und Formenbau, Universität Zhengzhou, 450002, Zhengzhou, China

Yong He

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MX führte alle Herstellungs- und In-vitro-Experimente durch und verfasste die Arbeit unter Einbeziehung aller Autoren. YS führte die Tierversuche und Charakterisierung durch. CZ und MG halfen bei der Durchführung der Tierversuche und der Charakterisierung. JZ war an der Gestaltung des In-situ-Bioprinting-Pfadprogramms und der Bedienung des Roboterarms beteiligt. JF, ZC und ZX haben zum Studiendesign beigetragen. YH organisierte das Projekt und gab Projektvorschläge.

Korrespondenz mit Yong He.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt Junji Fukuda und den anderen anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Xie, M., Shi, Y., Zhang, C. et al. In-situ-3D-Bioprinting mit Biobeton-Bioink. Nat Commun 13, 3597 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-30997-y

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Eingegangen: 09. November 2021

Angenommen: 20. Mai 2022

Veröffentlicht: 23. Juni 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-30997-y

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Naturkommunikation (2022)

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